蛋白质印迹(Western blot)实验方案
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
蛋白质印迹(Western blot)样品制备
蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。
目录∙裂解缓冲液∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂∙制备细胞培养物裂解物∙制备组织裂解物∙测定蛋白质浓度∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。
选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。
如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。
裂解缓冲液配方：NP-40 缓冲液∙150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）∙50 mM Tris，pH 8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。
如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）∙ 150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100∙0.5% 脱氧胆酸钠*∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）∙50 mM Tris，pH 8.0*可制备成10% 的母液，避光保存。
RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。
但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
western blot 蛋白印迹法
Western blot 蛋白印迹法原理：固相载体（硝酸纤维素膜）吸附蛋白质作为抗原，相应的一抗结合上蛋白质，再与同位素或荧光标记的二抗结合，经过底物显色或放射性自显影的方法，以检测电泳分离的目的蛋白。
既可定性，也可半定量检测蛋白质。
一、提取蛋白1、细胞数107，1*PBS洗涤细胞2遍（1500rmp 5min），转移到1.5ml EP管2、冰上操作，加入裂解液50-100ul混匀。
（蛋白裂解液：蛋白酶抑制剂=100：1）3、插入冰盒30min，每10分钟震荡混匀一次4、最高速离心，移上清至新的EP管中，记录液体体积数5、取2ul 4液体至58ul的PBS中，稀释30倍，Eppendorf biophotometer plus（爱普多夫核酸蛋白测量仪）测量蛋白浓度。
6、在4中加入1/4体积的5* loading buffer，混匀后99°C水浴变性10min（使之成为线性结构，暴露抗原），放-40度保存二、配胶1、玻璃板洗净：洗衣粉—自来水—双蒸水—烘箱烤干—齐、准、正向、上架子2、配胶加入TEMED充分混合后立即灌胶（边灌边摇晃枪头液体不要加完，防止进入空气）注意事项：灌分离胶时用1ml枪吸胶沿玻璃板放出，待胶面到绿带中间线高度即可（齿梳下缘1cm）处，封胶用水要慢，避免冲破胶。
30min，水胶分界清楚后胶凝。
胶凝后滤纸吸出水层，上浓缩胶，上胶后立即上梳子，梳子平行插入，避免产生气泡。
浓缩胶凝固后，将梳子竖直向上轻轻拔出（关键步骤，齿孔齐平！！）梳子两边加少量胶液，防止第一空变形。
3、用水冲洗浓缩胶，洗去孔内碎胶，将其放入电泳槽中。
加足够电泳液后准备上样（电泳液要浸没玻璃钢，外侧加到1/3）4、根据蛋白浓度，每孔蛋白30—100ug，上样约4—7ul，将枪头入孔加样，marker3—5ul。
5、接电源，80v起，蛋白跑到分离胶以后用100v 1h或90min，一直到溴酚蓝跑出胶即可终止电泳。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
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蛋白质印迹（Western blot）实验方案
溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。
Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液
150 mM NaCl
1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）
150 mM NaCl
1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
蛋白酶抑制剂
Tris-HCl 缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.5
蛋白酶抑制剂
电泳、转膜、封闭缓冲液
Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液
4% SDS
10% 2-巯基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl
测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS
测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇
测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。
转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
20% 甲醇
0.04% SDS
封闭缓冲液
5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）
加入 TBST 缓冲液中。
混匀并过滤。
过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。
实验步骤
样品裂解
1. 制备细胞培养物裂解物
.将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
.吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。
.用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
.在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。
.在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。
.轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。
将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。
2. 制备组织裂解物
.用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。
.将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。
将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。
对于约5 mg 的
组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，
用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回
旋振荡器上）2 小时。
. 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。
轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。
将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。
弃去沉淀。
样品制备
.取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。
确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。
我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
.还原和变性：在100 ℃下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸5 分钟，并进行分装。
在-20 °C 下保存裂解物。
注意：分装细胞裂解物(50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。
.在37 ℃下解冻装有细胞裂解物的离心管。
在微型离心机中以16,000 × g 离心5 分钟。
上样和电泳
.将等量的蛋白质和分子量标准上样到SDS-PAGE 凝胶孔中。
来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为20 - 30 μg，纯化蛋白的上样量为10 - 100 ng。
.在100 V 下电泳1 至2 小时。
膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。
用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF。
可能需要对时间和电压进行一些优化。
我们推荐按照制造商的说明进行操作。
可在封闭步骤之前用丽春红染色法检查转膜。
所得膜可用于抗体染色。
抗体染色
.用5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 ℃下封闭过夜。
.用适当稀释度的一抗在 5% 或2% 封闭溶液中 4 ℃过夜孵育膜，或在室温下孵育 2 小时。
.用 TBST 洗涤膜3 次，每次 5 分钟。
.用推荐稀释度的标记二抗在含 5% 封闭缓冲液的 TBST 中室温孵育膜 1 小时。
.用 TBST 洗涤膜3 次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。
.要产生信号，请遵循试剂盒制造商的建议。
.移除多余的试剂，并用透明塑料膜覆盖膜。
.利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
相关链接
查看所有 Abcam 上样对照
示例上样对照：ab8227 beta actin：
所有泳道：beta Actin 抗体 - 上样对照 (ab8227)，稀释度为 1/5000
泳道 1：HeLa 全细胞提取物
泳道 2：酵母细胞提取物
泳道 3：小鼠脑组织裂解物。