目的基因的克隆转化及重组子筛选
分子克隆——主要步骤
笔记3（分子克隆2——主要步骤）分子克隆可以分为以下几个步骤：分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。
1.带有目的基因的DNA片段的获得：可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。
2.重组DNA分子的构建：重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。
用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。
它们的基本特征是能够独立复制。
如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。
在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。
大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。
除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。
在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。
筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。
4.特定重组克隆的鉴别：由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。
使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。
此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。
主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
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实验报告题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选指导老师:丛佩清日期:2013/10/24-2013/10/26一．实验目的：(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。
(2)学习DNA连接的有关技术。
(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。
(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
(5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
二．实验原理：(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。
可用于PCR产物的克隆和测序。
(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。
(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。
诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。
三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1µl pMD19-T Vector、5µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅱ、350µlSolution Ⅲ、HiBind ® Mini Columns (I)、500 µlBuffer HB、1400 µlDNA Wash Buffer等四．实验步骤、现象、结果及分析：Ⅰ10月24号(1)cDNA电泳及胶回收1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2µl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。
2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。
表一：cDNA琼脂糖凝胶重量3.按1g/1ml 的量，大致各加入400µl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）；4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液；5.在柱子中加入300µl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液；6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液；7.10000g 离心1min（去乙醇）；8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。
加Elution Buffer 20µl。
室温放置1min，10000g 离心1min。
9.检测DNA的纯度和浓度，如下表二所示。
选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。
表二：cDNA吸光度测定（2）感受态细胞制备1.从新鲜培养的LB平板上挑单个DH5a大菌落接种到3mlLB培养液中，37 ℃剧烈振荡培养过夜（教师准备）。
2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a按1：50 取1ml菌液接种到50ml LB 培养基中，37 ℃振荡培养，1hr后用分光光度计测其OD值为0.182，1.5 hr后再测其OD值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期OD 600 为0.2-0.4）。
3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置10 min，5000 r/min，离心2 min ，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。
4.分别加入500µl预冷的0.1 mol/L CaCl2，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的CaCl2中，冰上放置10分钟。
5.离心机5000r/min，离心2min，用枪头吸取弃上清，分别加入100µl预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心用枪头吹散，0℃保存3hr 。
（3）连接和转化注：LB/Amp/IPTG/X-Gal平板配制：取固体LB培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80µl氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：样品组100µl、样品组200µl、正对照组、负对照组，然后在遮光条件下分别用三角玻璃棒涂布X-Gal 40µl和IPTG 10µl。
Ⅱ10月25号(1)取出过夜培养的4个平板，拍照并计数。
结果如下图所示：图一：样品组-100µl图二：样品组-200µl图三：正对照组图四：负对照组从上述四图可以看出，图三正对照组出现大面积蓝色菌落，证明空载质粒转化成功，平板边缘菌落呈白色，是因为LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制时是使用三角玻璃棒涂布X-Gal ，导致边缘不含或少含X-Gal 。
图四负对照组无菌落出现，因培养基中含氨苄青霉素，而感受态细胞无抗性，因而不能生存。
图一样品组-100µl 出现白色和蓝色菌落，证明重组质粒转化成功，图二样品组-200µl 也出现白色和蓝色菌落，但密度比图一高。
白色菌落密度偏高(与其他组相比)的原因：空载质粒的摩尔数=660g/mol×2692/g 10×1μμ×μl /ng 5-9ng=3×10-15mol插入DNA 片段的摩尔数=molg ngg /660×460/10×μl /ng 718.146×μl 49-=1.933×10-12mol空载质粒的摩尔数：插入DNA 片段的摩尔数≈1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA 片段过多，当时未稀释待插入DNA ，直接进行了转化实验，导致重组白色菌落密度偏大。
对图三正对照组蓝色菌落进行计数，将平板划均分为8块扇形，计数2块扇形部分内菌落数分别为850、650，平均为750，总计6000，空载质粒转化效率计算如下：1µl5ng/µl 即5ng 的质粒加入2号100µl 感受态细胞EP 管中，取50µl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/110050 5ng=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/µg 质粒（2）在超净工作台中，从样品组-100µl 中用牙签挑取白色阳性菌落接种于400µl LB-amp 培养基中，挑选4个菌落，分别接种于1号、2号、3号、4号试管中，于37℃振荡摇菌5hr 。
（3）配制10µl 反应体系，进行PCR 。
10µl 反应体系如下：菌液 DNA 2 µl 引物1（10 µM) 0.4 µl 引物2（10 µM) 0.4 µl 2 ×PCR Reaction Mix 5 µl Taq 聚合酶（2.5 U/µl ） 0.2 µl 超纯水 2 µl由于全班共配置100个反应体系，每组50µl ，从老师处领取后，自行分装8µl/管，分别标号1、2、3、4，再对应上午振荡培养的1号、2号、3号、4号菌液培养EP 管并从中取出2µl 作模板加入，后进行PCR 反应。
PCR 反应条件如下：94 ℃变性3 min ；94 ℃ 30 sec ，60℃ 30 sec ，72 ℃ 1 min ，30 个循环； 72 ℃ 10 min 。
（4）电泳：桌面薄膜依次点上marker 及1、2、3、4号PCR 产物各4µl ，再分别加入1µl SYBR Gold ，充分混匀，于1%琼脂糖凝胶中点样电泳。
（5）电泳完毕，取出凝胶，在紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图五所示：bp20001000750500250100图五：菌落PCR产物电泳示意图由上图可以看出，1、2、3、4号重组白色菌落PCR产物条带均在600bp左右，证明转化成功。
（6）随机从1号、2号、3号、4号菌液培养EP管中选取1号、2号，将菌液倒入1号、2号3ml LB-amp培养管中，37℃摇床过夜培养。
Ⅲ10月26号（1）质粒提取：1.取出过夜培养15hr的1号、2号试管，分别从中取1.5ml 的菌液加入1号、2号EP 管，于室温下10，000 xg离心1min 以沉淀菌种，由于菌液超过3ml，本实验步骤重复2次。
2.倒出培养基，往沉淀中加入250 µl SolutionⅠ/ RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。
3.往重悬混和液中加入250 µl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7次。
避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。
4.往上述混和液中加入350 µl Solution III ，温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
室温下，13，000 x g 离心10min.。
（提高离心速度有利于沉淀贴壁更加紧密）5.取两干净的HiBind ® Mini Columns (I) 各装在一个2 ml 收集试管上。
小心转移上清液至柱內，室温下10，000 x g 离心 1 min ，使裂解液完全流过柱子。
弃去收集管中的过滤液。
6.把柱子套在5所用的收集管上，加入500 µl Buffer HB 到柱子中，室温下10，000 xg 离心1min 洗涤柱子，除去残余的蛋白质。
7.弃去收集管中的滤液，加入700 µl DNA Wash Buffer ( 用无水乙醇稀释) 至柱子，室温10，000 x g离心1min ，弃去洗涤液。