珠磨破碎法
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细胞破碎技术
四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
细胞的破碎
该区域通透性增加
表面活性剂
❖ 天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 ❖ 合成的表面活性剂 离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴
化铵（阳离子型） 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等
表面活性剂Triton X-100－非离子型清洁剂 ❖ 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 ❖ 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， ❖ Triton X-100常与其它试剂混合使用。
目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli 基因工程菌，渗透出重组蛋白质。
复合试剂
❖ 根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有 效的提高胞内物质的释放率。
如：单独用0.1M的胍处理E. coli，可释放1％的胞内蛋白，用
0.5% Triton X-100可释放4％胞内蛋白，二者结合使用，在 同样时间内可使53％的胞内蛋白释放。
蜗牛酶适于酵母细胞的处理
自溶作用
❖ 通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自 身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。
❖ 自溶作用是酶解的另一种方法 ❖ 微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚
合结构的酶，以便使生长过程进行下去。 ❖ 改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生
物理法和化学法的比较
物理破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
3.2 细胞破碎方法
生物分离工程部分知识点
生物分离工程部分知识点生物分离效率三个指标：分离纯化浓缩程度，纯化倍数，回收率。
生物分离工程：从发酵液、酶反应液或动/植物细胞培养液中将目标产物提取、浓缩、分离、纯化和成品化的过程。
机械破碎法：固体剪切法(珠磨法、压榨法、撞击法) 液体剪切法（高压匀浆法、超声波破碎）工业常用方法：高压匀浆法、高速珠磨法。
优缺点：高压匀浆优点是细胞经历了高速造成的剪切、碰撞、高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
缺点是较容易造成堵塞的丝状真菌、放线菌以及较小的G+菌不适合用本法。
高压匀浆一般需多级循环操作，每次循环前需要进行级间冷却。
主要能耗是高压和维持低温操作能量消耗。
高速珠磨破碎法：破碎率与能耗成正比。
增加装珠量或延长破碎时间或增加转速均可提高破碎率，但同时能量消耗和产热增加，提高了制冷费和总能源消耗量。
当破碎率≥80%，能耗急剧增加。
超声波破碎：有效能量利用率低，冷却要求苛刻。
①常用的蛋白质沉淀方法有：盐析沉淀（硫酸铵，低温）、等电点沉淀、有机溶剂沉淀（丙酮/乙醇等有机溶剂）及热沉淀法等。
②有机溶剂沉淀蛋白质的机理是：向蛋白质溶液中加入有机溶剂，水的活度降低。
随着有机溶剂溶度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团的水化程度降低，液体的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。
盐析的主要因素有无机盐的种类，浓度，温度和pH值。
lgS=-β—KsI。
盐的种类影响KS值，离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果好。
温度和pH值影响β，在高离子强度溶液中，温度上升，有利于某些蛋白质失水，因此温度升高，蛋白质溶解度下降。
pH值接近蛋白质等电点有利于提高盐析效果。
水相pH值对弱电解质分配系数具有显著影响。
物理萃取时，弱酸性电解质的分配系数随pH值降低而增大，弱碱性电解质随pH值降低而减少。
弱电解质在水相中发生不完全解离，仅仅是游离酸或游离碱在两相产生分配平衡，而酸根或碱基不能进入有机相，所以萃取达到平衡状态时，一方面弱电解质在水相中达到解离平衡，另一方面，未解离的游离电解质在两相中达到分配平衡。
细胞破碎技术与方法
细胞破碎技术与方法细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
由于细菌、酵母、真菌、植物都有细胞壁，但成分不同，且同类细胞结成的网状结构不同，因此其细胞壁的坚固程度不同，总体呈现递增态势。
动物细胞虽没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要一定的细胞破碎方法来破膜，达到提取产物的目的。
细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。
具体如下：化学法渗透冲击破碎法• 方法：渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。
反复冻融法• 方法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。
由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
酶溶破碎发法• 方法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。
有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。
• 特点：a) 此法适用多种微生物b) 具有作用条件温和c) 内含物成分不易受到破坏d) 细胞壁损坏的程度可以控制• 存在的问题：a) 易造成产物抑制作用b) 溶酶价格高c) 酶溶法通用性差化学试剂法• 方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。
细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法1前言目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。
破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。
自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。
很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。
因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。
2细胞破碎技术2．1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
常见的细胞破壁方法对比
超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量缺失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。
常见的细胞破壁方法对比
破碎原理
缺点
高压匀浆法
设备是高压匀浆器，它由高压泵与匀浆间构成，其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞与由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。
较易造成堵塞的团状或者丝状真菌，较小的革兰氏阳性首与有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。
高速珠磨法
微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间与珠子与细胞之间与互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。
操作参数多，通常赁经验估计同时珠子之间的液体缺失30％左右
超声破碎
酶溶法
就是用生物酶将细胞壁与细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。
易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不一致菌种需选择不一致的酶。
化学渗透法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都能够改变细胞壁或者膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型与细强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
高速珠磨法破碎细胞综述
高速珠磨法破碎细胞综述摘要：随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。
很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。
而目前高速珠磨匀浆法和高压匀浆法不仅在实验室被广泛采用，而且在工业生产上高速珠磨匀浆法也是一种有效的细胞破碎方法。
关键词：高速珠磨机细胞破碎1、结构：高速珠磨机又称砂磨机，研磨作业是在全密闭且具有压力的研磨缸内高速运转研磨，所以没有溶剂挥发污染空气的问题，能确保操作人员的身心健康，更因为没有溶剂挥发而节约能源，降低生产成本。
由机身、主传动、分散器、送料泵、无级变速器、冷却系统、电气控制器等组成；直立式整体性设计，将研磨主机和送料泵以及电气控制箱集为一体，使立式砂磨机不占空间，操作方便；研磨缸为冷却夹套型设计，使冷却水能一进一出，以冷却砂磨机研磨作业中产生的温度。
珠磨机的破碎腔由夹套组成，夹套内通冷却剂可以移出细胞破碎时产生的热量。
破碎腔内装有直径约1mm的无铅玻璃珠或其他材质的微珠。
当启动电机后，玻璃珠随搅拌桨转动而进行各种形式的运动，从而珠子与细胞之间产生了撞击和剪切效应，使细胞破碎，释放出内含物。
在细胞匀浆液出口处设置了珠液分离器滞留珠子，使珠液分离破碎能够连续进行。
珠磨机是破碎率较高的细胞破碎机，常用于生物药物的生产中。
2、破碎机理：高速珠磨法也是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（1）。
微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂（通常是直径<1mm的无铅玻璃珠）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂，释出内含物。
在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。
破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。
]1[影响珠磨破碎的因素很多，一旦珠磨机的硬件确定，则只有某些操作参数待定，如转速、进料速度、珠子直径与用量、细胞浓度、冷却温度等。
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珠磨破碎法
珠磨破碎法是一种常用的破碎工艺，广泛应用于矿山、冶金、建材等行业。
本文将从珠磨破碎法的原理、设备、优缺点等方面进行详细介绍。
一、珠磨破碎法的原理
珠磨破碎法是利用珠磨机进行破碎的一种方法。
珠磨机是一种高速回转的圆筒体，内部装有大量的研磨珠。
当物料经过珠磨机时，由于离心力和摩擦力的作用，物料与研磨珠之间发生强烈的碰撞、摩擦和剪切，从而使物料得到破碎。
珠磨破碎法的主要原理可以总结为以下几点：
1. 研磨珠的高速回转产生的离心力使物料受到强烈的冲击和剪切力，从而使物料破碎。
2. 研磨珠与物料之间的摩擦力也是破碎的重要因素，摩擦力的增大有助于物料的破碎。
3. 物料在珠磨机内部通过多次碰撞和剪切，逐渐减小颗粒的大小，最终实现破碎的目的。
珠磨机是珠磨破碎法的核心设备，根据物料的不同特性和生产要求，可以选择不同类型的珠磨机。
常见的珠磨机有立式珠磨机和水平珠磨机两种。
立式珠磨机是将研磨珠和物料一起放入研磨室内，通过研磨室内的
搅拌器高速回转，使研磨珠和物料充分混合，实现破碎效果。
水平珠磨机是将研磨珠和物料一起放入研磨室内，通过研磨室内的离心轮高速回转，使研磨珠和物料产生强烈的摩擦和碰撞，达到破碎的目的。
三、珠磨破碎法的优缺点
珠磨破碎法具有以下优点：
1. 对于一些难破碎的物料，珠磨破碎法可以有效地进行破碎，提高破碎效率。
2. 研磨珠的选择范围广泛，可以根据物料的特性和要求选择不同材质和大小的研磨珠，提高破碎效果。
3. 破碎过程中不需要加入其他辅助物质，对环境污染小。
珠磨破碎法也存在一些缺点：
1. 破碎过程中会产生较多的热量，可能导致物料的变质或燃烧。
2. 研磨珠的磨损较大，需要定期更换，增加了生产成本。
3. 对于一些易磨损的物料，珠磨破碎法可能会造成颗粒过细，不利于后续的分离和提取。
四、珠磨破碎法的应用
珠磨破碎法广泛应用于矿山、冶金、建材等行业。
具体应用领域包括：
1. 矿山：用于矿石的细磨和选矿过程中的破碎。
2. 冶金：用于金属矿石的破碎和粉磨，以及冶金废料的处理。
3. 建材：用于水泥、陶瓷等材料的破碎和粉磨。
4. 化工：用于化工原料的破碎和粉磨，以及颜料、涂料等的制备。
珠磨破碎法是一种高效、广泛应用的破碎工艺。
通过珠磨机的高速回转和研磨珠与物料之间的碰撞、摩擦和剪切，可以将物料破碎为所需的颗粒大小。
珠磨破碎法具有破碎效率高、操作简便等优点，但也存在热量产生较多、研磨珠磨损大等缺点。
在实际应用中，需要根据物料的特性和生产要求，选择合适的珠磨机和研磨珠，以获得最佳的破碎效果。