SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。
当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。
本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。
不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。
SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。
即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。
样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要 充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形 瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米 左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性 完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内， 再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即 可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理;
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种蛋白质分析方法，常用于测定蛋白质的相对分子量。
其原理是利用SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带负电，使蛋白质在凝胶中按照相对分子量大小进行分离。
具体原理如下：
1. SDS：SDS是一种表面活性剂，它可以与蛋白质发生结合，使得所有蛋白质带有相同的电荷密度。
2. 蛋白质解不性：在SDS存在条件下，蛋白质发生解性，其中SDS会形成不溶解的复合物，使蛋白质具有均一负电荷。
3. 凝胶电泳：将SDS处理后的蛋白质样品加于聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板上，施加电场使蛋白质迁移。
4. 分离：由于凝胶电泳胶阻力不同，蛋白质经过一段时间后在凝胶上分离成锥形区带。
5. 相对分子量测定：在同一凝胶中，已知相对分子量已知的标准蛋白质样品与待测蛋白质样品进行分析，通过对比标准蛋白质样品的迁移距离和待测蛋白质样品的迁移距离，可以推算出待测蛋白质样品的相对分子量。
需要注意的是，由于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是以相对分子量进行分析的，所以对于蛋白质的准确分子量测定，还需结合其他方法如质谱等进行综合分析。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
甘氨酸
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组 分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形 成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两 边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质 前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳 动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的 区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
Ø 加入加速剂TEMED后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。
保存条件： 4℃保存。
注意事项：
Ø 易燃，有腐蚀性，请注意防护。
Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20
性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发 剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外， 它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项：
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浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离 胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。 在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔 径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只 有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左 右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞ H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。电 泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压 梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间 形成—个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好 介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成— 条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
生物化学实验十一 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测
实验十一SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子质量一、目的要求学习和掌握采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子质量的基本原理和方法。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合交联形成的三围网状结构。
通过改变单体Acr浓度或单体与交联剂的比例可以控制凝胶孔径的大小，这取决于两个重要的参数T和C，其中T是两个单体（Acr和Bis）的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分浓度。
T=（a+b）/m×100(%) C=b/(a+b)×100(%)式中，a为Acr质量（g）；b为Bis质量（g）；m为水或缓冲液的终体积（mL）。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续系统两种。
在连续系统中，电泳槽中缓冲液的pH与凝胶中一致，而在不连续系统中上述两者的pH不相同，不连续系统的分辨率较高。
从凝胶形式上可分为柱式或板式。
将凝胶装于垂直的玻璃管中进行电泳分离称柱式电泳，此法制备凝胶方便，样品需要量少，凝胶条便于长期保存；板式电泳的优点是可以在同一凝胶板上同时检测盒比较多个样品，在平板电泳的基础上还建立了分辨率更高的双向电泳。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统具备三种效应，因此大大提高了分辨率。
(1)浓缩效应：在电泳开始时，样品在浓缩胶与分离胶界面上形成了高度压缩的薄层，作为在分离胶中进一步分离的起始样层，有时甚至能浓缩几百倍。
(2)电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带。
由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。
(3)分子筛效应：当蛋白质分子通过浓缩胶进入分离胶时，颗粒小、呈球形的样品分子移动快，柯利达、形状不规则的分子在通过凝胶空洞时的阻力大，移动就缓慢。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质分子的主要极力为上述的电荷效应和分子筛效应，即这些分子所带净电荷的差异和分子质量大小的不同。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于分子的电荷与分子的质量之间的相互作用，通过电场驱动，将蛋白质样品分离成不同的带状条带。
该方法的工作原理可分为以下几个步骤：
1. 样品制备：将待分离的蛋白质样品与sds（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质样品在含有还原剂的缓冲液中发生变性并且呈带负电荷的复合物。
2. 样品加载：将样品加载到预制的聚丙烯酰胺凝胶槽中的样品孔中。
通过上下两个电极施加电压使样品向凝胶孔移动。
3. 分离：当电压施加后，带电的蛋白质复合物将根据其质量和电荷大小在凝胶中移动。
较小的蛋白质在电场作用下通过凝胶孔移动更快，而较大的蛋白质移动较慢。
4. 染色：在分离完成后，经过染色处理使分离出的蛋白质带呈现出可视化的条带。
常用的染色方法包括银染、共染和荧光染色等。
通过观察得到的条带模式，可以确定蛋白质的分子质量和其含量。
这种方法比较简单、经济且广泛应用于蛋白质研究领域。
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一、概述
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋 白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时， 其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、 分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去 污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键 打开，使蛋白质变性， SDS将包裹在变性蛋白表面， 使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量 负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情 况下，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的 SDS量，即蛋白质分子的大小。因此利用SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
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三、操作步骤
1、分离胶的制备 (1). 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度，制备不同浓
度的凝胶所需的储备液可参考下表，该配方可配制0.75mm 厚、10cm X 7cm的凝胶。在配制凝胶时，将水、30％Acr 和Bis储液、4X分离胶储液混合完全后，真空脱气5分钟， 然后加入过硫酸胺和TEMED，立即准备灌制凝胶。
F. 2X样品缓冲液 称取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10% SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、β-巯基乙醇 0.5ml，加水定容至10ml。
G. 染色液 称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入甲醇450ml，冰 乙酸l00ml、水650ml。
H. 脱色液 甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水800m1.
(3). 电泳：通常使用稳流的方式进行电泳，电流一 般为18mA，时间大约3-4小时。
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4、凝胶的染色与脱色 A. 电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心
槽。小心地取出凝胶，置于染色液中染色 4小时，并不时地轻轻晃动。染色完毕后， 倒去染色液，用少量水淋洗凝胶，然后置 于脱色液中脱色，并轻轻晃动，脱色至蓝 色背景消失为止。此凝胶即可用于分析。 B. 考马斯亮蓝检测灵敏度为0.3-1 ug/蛋白带。 C. 银染检测灵敏度为0.1-1.0 ng/蛋白带,比考 马斯亮蓝检测灵敏度高100-1000倍。
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不同浓度凝胶的制备
成
不同浓度所需的储备液体积
份
8.5% 10% 12.5％ 15％ 17.5%
H20
3.5ml
30% Acr和Bis分离胶 2.0ml
4X缓冲液
l.9ml
10% 过硫酸铵
112 u1
TEMED
5 ul
3.1ml 2.5ml 1.8ml 2.4ml 3.Oml 3.7ml 1.9ml 1.9ml 1.9ml 112 ul 112 ul 112 ul 5 ul 5 ul 5 ul
1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul
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2. 浓缩胶制备的方法
(1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml，浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 ％过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后， 立即灌胶。
(2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中， 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡，待聚合完 全后即可拔去梳子，准备电泳。
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二、试剂
A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯 酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，过滤后存 于棕色瓶中，于4℃保存。
B. 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18．17g，加入10%SDS贮备液2). 将混合液充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平 板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作过程中不能产生任何 气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。
(3). 置于室温下15-30分钟，使凝胶聚合完全 (在水相和凝胶的交 界处有一明显的亮线)。除去上层水相，然后再用水或浓缩 胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI，pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝 胶表面，准备灌制浓缩胶。
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C. 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g，加入10%SDS 4ml，用 l2mol/L HCI调pH至6．8，定容至100ml。
D. 10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.5g，加水至5ml。本储存液 应现配现用。
E. 10X电极缓冲液 称取Tris 30g、甘氨酸144g，加入 10%SDSl00ml，定容至1000ml。
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3. 样品制备及电泳
(1). 样品处理：蛋白质样品和分子量标准蛋白质在 上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶 液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中，将混合物置于95-100℃加热5分钟，立即 置于冰上，或于-20℃储存，以便再次分析时使 用。
(2). 上样：样品制备好以后，即可上样电泳。先将 样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然 后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽 中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验 的需要加样电泳。