分子生物学实验
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法1.DNA提取与纯化DNA提取是分子生物学实验中最常用的技术之一，用于从不同种类样本中提取纯化DNA。
常见的提取样本包括细菌、动植物组织以及人体样本。
提取过程通常包括细胞破碎、蛋白质除去、DNA溶解和纯化等步骤。
常用的提取方法包括酚/氯仿提取法、CTAB提取法和商业化提取试剂盒。
2.PCR（聚合酶链反应）PCR是一种高效扩增DNA的技术，可将一小段目标DNA序列扩增成数百万个拷贝。
PCR反应通常包括DNA模板、两个引物、dNTPs（四种核苷酸单元）和DNA聚合酶等成分。
反应的核心步骤是多个高温循环，包括变性（解开DNA的双链）、退火（引物结合到目标序列）和延伸（DNA聚合酶合成新链）等步骤。
PCR广泛应用于分子克隆、基因表达研究、疾病诊断等领域。
3.转染和转化转染和转化是将外源DNA导入宿主细胞中的技术。
转染是指将DNA导入非真核细胞（如细菌）或真核无性细胞中，常用的方法包括电穿孔法、化学法和病毒载体介导等。
转化是指将外源DNA导入真核多细胞直至整个个体范围内，常见的方法包括冷冻转化、冲击转化和基因枪法等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤。
常见的表达系统包括细菌系统（如大肠杆菌）、酵母系统（如酵母菌）和哺乳动物细胞系统（如CHO细胞）。
表达后，蛋白质需要经过多个步骤进行富集和纯化，如离心、柱层析和亲和层析等。
以上仅是分子生物学实验方法中的一部分，随着技术的发展，分子生物学实验方法也在不断更新和扩展。
这些实验方法在疾病诊断、基因工程、生物学研究等领域发挥了重要作用。
分子生物学实验
实验一：细胞的传代与培养实验材料：1、细胞：PC12细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％胎牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养板，吸液枪，酒精灯等实验原理：从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
操作步骤：1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1到2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、放入培养箱中消化2-3分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代。
5.根据确定的比例来取需要的量，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养皿放入培养箱7.收拾整理超净台实验结果：生长良好的PC12细胞图如下：实验二：MTT比色法实验材料：1、细胞：PC12细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％胎牛血清）、DMSO、MTT 溶液MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
常见分子生物学实验方法
常见分子生物学实验方法1.DNA/RNA提取DNA和RNA提取是进行分子生物学实验的第一步。
常见的提取方法包括酚/氯仿法、离心法、基于载体的提取等。
这些方法可以从细胞、组织或血液中提取出高质量的DNA或RNA用于后续实验。
2.PCR扩增聚合酶链反应（PCR）是一种常用的体外DNA扩增技术，用于复制特定DNA片段。
通过PCR，可以从少量的DNA样本中扩增目标序列，并与特异性引物一起进行扩增。
PCR具有高度特异性和灵敏度，广泛应用于基因克隆、基因检测和定量分析等领域。
3.基因克隆基因克隆是指将特定目标基因从一个有机体中分离并插入到另一个有机体中。
常见的基因克隆方法包括限制性内切酶消化、连接、转化、筛选等。
基因克隆可以用于生成重组DNA、构建表达载体、设计并构建突变基因、重组蛋白质等。
4.蛋白质表达和纯化蛋白质表达和纯化是研究蛋白质功能和结构的重要步骤。
常见的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
表达后，通过亲和纯化、离子交换层析、凝胶过滤等手段纯化所得蛋白质。
5.基因敲除/敲入基因敲除或敲入是通过改变目标基因的DNA序列来研究基因功能的方法。
基因敲除可以通过CRISPR-Cas9系统、RNA干扰、转座酶介导的基因敲入等方法实现。
6.DNA测序DNA测序是分析DNA序列的方法。
常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等）等。
DNA测序可以应用于基因组学、转录组学、评估其中一区域的突变等领域。
7.西方印迹西方印迹是一种蛋白质检测方法，用于检测和定量特定蛋白质的存在和表达水平。
通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，并使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过酶标记二抗或荧光二抗的检测。
8.荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量分析DNA或RNA浓度的方法。
通过特异性引物、探针与目标序列的结合，实时检测并记录PCR扩增产物的信号，进而测定起始目标序列的数量。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是一种研究生物体分子结构、功能和交互作用的实验方法。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常用技术，并以DNA提取和PCR扩增为例，详细描述了实验的具体步骤和操作。
分子生物学实验一般包括以下几个步骤：实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等。
实验前的准备包括实验设计、试剂的准备和设备的调试。
根据实验目的和问题，确定实验设计和具体操作步骤，选择适当的试剂和设备，并对实验条件进行优化。
生物样品的采集和处理是分子生物学实验的基础。
根据研究对象不同，可以采集细胞、组织、血液等生物样品，并进行预处理，如细胞培养、组织切片、离心等。
核酸提取是从生物样品中分离出核酸的步骤。
核酸提取可以使用化学方法或基于特定原理的商业试剂盒。
其中，常用的方法有酚/氯仿法、骨架蛋白法、磁珠法等。
酶切和电泳是分子生物学实验中常用的技术手段。
酶切是通过限制性内切酶对DNA进行特异性切割，生成特定大小的DNA片段。
电泳是利用电场对DNA片段进行分离和检测，可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
PCR扩增是一种重要的分子生物学实验技术。
PCR通过不断循环的变性、退火和延伸过程，在体外扩增DNA序列。
PCR 需要DNA模板、引物、核苷酸和聚合酶等关键试剂。
PCR扩增过程包括初始变性、循环扩增和最终延伸。
扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和检测。
蛋白质表达是研究蛋白质功能和结构的重要实验手段。
常用的蛋白质表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。
表达载体经过构建和转染后，利用细胞的表达机制使蛋白质在体内合成。
总之，分子生物学实验是研究生物体分子结构和功能的重要方法。
通过实验前的准备、生物样品的采集和处理、核酸提取、酶切和电泳、PCR扩增、蛋白质表达等步骤，可以获得关于生物体分子结构和功能的有价值的信息。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是研究生命分子结构和功能的基础。
分子生物学的研究对象是生命体内的DNA、RNA、蛋白质等生物分子，通过实验可深入了解生命分子的结构及其功能，为治疗疾病等产生重要的科研意义。
本文将着重介绍PCR扩增、基因克隆、蛋白质表达和酶联免疫吸附实验等分子生物学实验。
PCR扩增PCR扩增是分子生物学领域中使用最广泛的实验技术之一。
PCR扩增技术是通过不断的复制，使DNA分子增多。
PCR主要操作步骤包括：DNA样品提取、模板DNA扩增、DNA回收纯化和定量检测等。
PCR扩增实验分为两部分：第一部分是制备PCR反应混合物，包括模板DNA、引物（Primer）、反应缓冲液、酶、脱离剂、种子液等。
制备反应混合物的过程中，需要将所有的试剂按照一定比例混合后，将混合液均匀吸入PCR管内。
第二部分是PCR反应实验本身，包括控制PCR反应温度变化、确保每个PCR 反应的时间和温度一致、等等。
PCR反应时间通常在2-6小时之间，取决于所扩增的DNA片段的长度和针对不同目标所使用的引物。
基因克隆基因克隆是利用重组DNA技术将外源DNA和载体DNA组装重组成新的DNA分子，然后通过转化等方式将新的DNA分子转移到感受态宿主细胞中，使得新的DNA分子被细胞所接受并复制，从而达到克隆目的的一种实验方法。
基因克隆实验的主要操作步骤包括：选取适当的载体，将所需要的外源DNA和载体DNA连接起来组成重组DNA分子，将重组DNA分子转化至感受态宿主细胞中，最后从发酵液中提取所需的目标DNA分子。
基因克隆技术在分子生物学实验研究中起到了重要的作用，使得我们能够制备大量目标分子用于进一步的研究。
蛋白质表达蛋白质表达是一种将蛋白质合成出来的实验技术。
蛋白质表达技术的主要目的是利用外源基因的扩增技术，将目标蛋白表达并纯化出来，从而进一步深入了解蛋白质的结构及其功能。
蛋白质表达实验的主要操作步骤是：蛋白质的基因落库、基因克隆到重组基因载体中、启动子、子纯化表达及活性鉴定等。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学实验
分子生物学实验1. 幸免长时刻的培养，大肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。
要紧是因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。
重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。
其他未重组菌在Amp存在的情形下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就能够生长了。
卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，那么无抗性的菌也生长出来了。
一句话，你的板子培养时刻过长了。
这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col 分泌beta内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。
2.3.乙醇能够排除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
Na＋之类的平稳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。
因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。
1.什么缘故用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇〔因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵〕。
然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一样在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，什么缘故一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验1.基因克隆实验：基因克隆实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的DNA序列克隆到重组DNA分子中。
这个实验通常包括DNA的摘取、PCR扩增、限制性内切酶的消化、连接载体、转化大肠杆菌等步骤。
2. 蛋白质表达实验：蛋白质表达实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质表达到大肠杆菌等宿主细胞中。
这个实验通常包括将感兴趣的基因克隆到表达载体中，表达载体转化至宿主细胞，利用诱导剂等物质诱导表达蛋白质等步骤。
3. PCR实验：PCR实验是一种基于酶催化反应的分子生物学实验。
该实验通过模板DNA、引物、酶及核苷酸等原料，经一系列温度变化，扩增目标DNA片段。
该实验通常用于基因克隆、DNA测序、点突变检测等领域。
4. DNA测序实验：DNA测序实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是确定DNA序列。
这个实验通常包括PCR扩增、DNA纯化、测序反应、数据分析等步骤。
5. RNA干扰实验：RNA干扰实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
这个实验通常包括制备siRNA、合成siRNA、转染细胞等步骤。
6. 蛋白质纯化实验：蛋白质纯化实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质从混合物中提纯出来。
这个实验通常包括细胞裂解、纯化、检测等步骤。
7. 荧光检测实验：荧光检测实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用荧光分子标记分子或细胞等，观察其分布、表达及功能等。
这个实验通常包括荧光染色、荧光显微镜观察等步骤。
8. 基因编辑实验：基因编辑实验是一种新兴的分子生物学实验，其目的是通过基因编辑技术，直接改变DNA序列，从而实现对基因的修饰。
这个实验通常包括CRISPR/Cas9等基因编辑技术的设计、实现、检测等步骤。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
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实验一.质粒提取与琼脂糖电泳一、目的掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。
二、原理1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。
在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。
2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。
在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：大肠杆菌DH5α（2）分子生物学试剂10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。
50×TAE电泳缓冲液:24.2g Tris5.71g 冰乙酸10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
6×上样缓冲液:0.25% 溴酚蓝40%（W/V）蔗糖水溶液1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。
(4) 细菌培养基含抗生素的LB培养液酵母提取物 5g蛋白胨 10gNaCl 10g琼脂 15～20g水 1000mL，必要时，调整至pH 7.4～7.6将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
灭菌后的LB培养基可室温保存，使用前加入相应抗生素。
含抗生素的LB培养基应放入4O C 冰箱内暂存。
含抗生素的LB琼脂平板LB培养基中加15 g琼脂，以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
待培养基温度降至40-42O C，加入相应抗生素，摇动培养基，使抗生素与培养基充分混匀。
将培养基倒入细菌培养皿，凝固后倒置。
6小时后放入4 O C冰箱备用。
（5） Promega EastepTM质粒小提试剂盒（6）其它准备物品1mL、100μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mL eppendorf管；试管及试管塞：小型离心机；无水乙醇。
四、实验步骤（一）大肠杆菌的制备从新鲜LB琼脂平板（含抗生素）上挑出单个菌落接种于5ml LB培养液中（含相同的抗生素），于37°C摇床培养过夜（12-16小时）。
（二）大肠杆菌的裂解1.将1-5ml (高拷贝数的质粒)或10ml（低拷贝数的质粒）的细菌培养物于10,000×g 离心5分钟。
弃去上清液，并吸去剩余培养液。
2.加入250μl细胞悬浮液，震荡或吹打以充分混匀细胞。
充分混匀细胞非常关键。
如果悬浮的细胞不在离心管中，则将其转移至1.5ml无菌离心管中。
注意：以下操作步骤不要震荡以避免切断染色体DNA。
3.加入250μl细胞裂解液，颠倒离心管4次以充分混匀（不要震荡）。
室温孵育细胞悬浮液至澄清，孵育时间大约需要1-5分钟。
注意：在加入碱性蛋白酶溶液（第4步）之前观察裂解液是否变为澄清非常重要。
但孵育时间不要超过5分钟。
4.加入10μl 碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混匀。
于室温孵育5分钟。
碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。
碱性蛋白酶孵育时间不要超过5分钟，否则质粒DNA会出现缺口。
5.加入350μl 中和溶液并迅速颠倒离心管4 次以充分混匀（不要震荡）。
6.于室温将细胞裂解液以最大速度（约14,000×g）离心10 分钟。
取澄清裂解液进行以下步骤的质粒DNA的分离及纯化。
(三) 质粒DNA的纯化7．准备好微量纯化柱和收集管。
一个样品需要一个微量纯化柱和一个收集管，将微量纯化柱插入收集管中。
8．用移液枪将澄清裂解液（大约850μl）转移到准备好的微量纯化柱中，避免碰到沉淀物。
注意：如果转移过程中不小心带入了白色沉淀物，需将微量纯化柱中的内含物重新转移到一个无菌1.5ml离心管中并以最大速度离心5-10分钟。
再将离心后的上清液转移至先前使用的微量纯化柱中。
微量纯化柱可以重复使用，但仅限于同一样品。
9．于室温，14000×g离心1分钟，将微量纯化柱从收集管上移开，弃去收集管中的液体后重新装回到收集管上。
10．加入750μl柱清洗液（已加95%乙醇）。
11．于室温，14000×g离心1分钟，清空收集管。
12．加入250μl柱清洗液重复清洗步聚（已加95%乙醇）。
13．于室温，14000×g离心2分钟。
14．从收集管上取下微量纯化柱并转移至无菌1.5ml离心管中。
操作时需小心，在转移微量纯化柱到离心管中时切勿带入清洗液。
如果微量纯化柱上粘有柱清洗液，则需要重新以最大速度离心1 分钟，以甩掉柱清洗液后再转移到离心管中。
15．加入100μl无核酸酶水，于室温，14000×g离心1分钟。
不加缓冲液的DNA水溶液可保存在—20°C或更低的温度下。
如果需要将DNA保存于TE缓冲液中，则在100μlDNA中加入11μl 10×TE缓冲液，加了TE缓冲液中的DNA保存在4°C是稳定的。
（四）琼脂糖凝胶电泳1．将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2．调整好梳子的高度；3．称取0.24 g琼脂糖于30 ml 1×TAE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50o C时加入核酸染料，倒入制胶板中；4．凝胶凝固后，小心拔去梳子；5．将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，6．将电泳样品与6X loading buffer 混合后将样品依次加入加样孔中；打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7．电泳完成后切断电源，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。
五、结果分析电泳检测可看到几条带? 提取EGFP质粒的纯度分析。
六、思考与分析1．提取质粒分子量如何确定?能通过与核酸分子量Marker比较确定质粒分子量吗? 为什么?2．质粒提取过程中各试剂的主要作用。
感受态细胞的制备和转化一．目的•掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法•掌握质粒转化的技术方法二．原理体外连接的DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。
为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。
Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
三、实验材料、仪器、试剂（1）菌种：DH5a（2）分子生物学试剂0.1 M CaCl250% 甘油(3) 细菌培养基含抗生素的LB培养液酵母提取物 5g蛋白胨 10gNaCl 10g水 1000mLpH 7.4～7.6（4）其它准备物品1mL、100μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mL eppendorf管；试管及试管塞：小型离心机；摇床；细菌培养箱。
四、实验步骤（一）大肠杆菌DH5a感受态的制备1.前夜接种受体菌（DH5a），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2.取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm），摇至细菌OD为0.4-0.6；溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作3.将0.1M CaCl24.吸取培养好的菌液至50ml离心管中，在冰上冷却30分钟；5.4℃下3000 g冷冻离心10分钟；6.弃去上清，加入10ml 预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7.4℃下3000 g冷冻离心10分钟；8.弃去上清，加入1ml 预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加0.5ml 50%甘油超低温冷冻贮存备用（－70℃）（二）质粒的转化1.制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中加入适量抗生素，混匀后倒入灭菌培养皿中；2.制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3.每100 μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，以商品化感受态细胞为阳性对照，感受态中不加质粒DNA为阴性对照；4.DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；5.热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；6.冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置3分钟；7.复苏：每管加400 ml LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；8.布皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素的LB平板；9.培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16 小时即可观察到白色菌落。
五、结果分析菌落计数；观察菌落大小，均一性。
六、思考与分析1．影响感受态效率的因素是什么？2．质粒转化后，37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏的目的是什么？多聚酶链式反应（PCR）一．目的掌握PCR扩增原理及方法；巩固琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。
二．原理PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。