羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法

羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解

（适用于各种抗氧化剂）

文献来源

[1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl

radical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088.

操作图解

图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图

具体方法

1 溶液配制

0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。

0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。

磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。

Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。

FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。

抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。

H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。

脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。

三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。

硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。

样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。

2 操作方法与注意事项

2.1 操作方法（见图1）

2.2 注意事项

1 测试前，一定要检查试管是否干净，不净的试管不能用。正式测试前,盛装样品的容器(小瓶或试管)

必须用铬酸洗液洗净。

2 样品溶液加入到试管后，先彻底挥干溶剂，再用样品的残渣，进行实验检测（见：操作图解）。这一步至关重要，因为有机溶剂都会产生数十倍的干扰。其原因中文献[1]已做详细说明。

3 最后显色时，如颜色太淡，可能是加热温度不够高；

4 加样：在10μL以下最好用进样针，插到瓶底；取样：力保均匀。

5 如平行样之间差别太大，系混合不均所致。两次水浴前，都要充分振荡。振荡时，用保鲜膜盖住管

口上下剧烈振荡。

3 计算公式

清除率00A -A

% = 100%A

4 实验结果（以咖啡酸Caffeic acid 为例）

采用文献[1]的改进方法，用样品残渣检测，消除了溶剂干扰，其结果如下图的黑线；如果不挥干溶剂（醇溶液），结果则为红线。从IC 50值分析，相差10倍以上。

图2 咖啡酸的·OH 自由基的清除能力的对比（挥干溶剂vs 样品溶液）

致谢：本文由论文原作者广州中医药大学李熙灿教授提供，特此致谢。