羟基自由基清除能力测定法的简易操作图解-脱氧核糖降解法-脱氧核糖分析法
羟自由基清除能力测定原理
羟自由基清除能力测定原理一、引言羟自由基是一种高活性的化学物质，具有很强的清除能力。
羟自由基清除能力测定是一种常用的方法，用于评估化合物对自由基的抗氧化能力。
本文将介绍羟自由基清除能力测定的原理和相关实验方法。
二、羟自由基的产生羟自由基是一种带有羟基（OH）的自由基，具有很强的氧化能力。
羟自由基可以通过多种途径产生，例如光解水、氧化还原反应以及生物代谢过程中的产生等。
在实验室中，常用的产生羟自由基的方法是通过添加氢过氧化物和过氧化氢催化剂来进行。
三、羟自由基清除能力的评估方法1. 直接测定法直接测定法是最常用的羟自由基清除能力评估方法之一。
该方法利用特定的化学试剂（如5,5-二甲基-1-吡咯烷酮）与羟自由基发生反应，生成稳定的产物，通过测定产物的浓度变化来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单、结果可靠。
2. 电子自旋共振法电子自旋共振法是一种基于电子自旋共振谱仪的测定方法。
该方法利用特定的探针与羟自由基反应生成稳定的产物，通过测定产物的电子自旋共振信号强度来评估清除能力的大小。
该方法对样品要求较高，需要配备专业的设备。
3. 化学计量法化学计量法是一种通过测定特定试剂的消耗量来评估羟自由基清除能力的方法。
该方法常用的试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽等，通过与羟自由基反应生成稳定的产物，进而测定试剂的消耗量来评估清除能力的强弱。
该方法操作简单，适用于大批量样品的测定。
四、影响羟自由基清除能力的因素羟自由基清除能力受多种因素的影响，包括温度、pH值、浓度、反应时间等。
一般来说，较高的温度、适宜的pH值和较长的反应时间有助于提高羟自由基清除能力。
此外，样品的浓度也是影响清除能力的重要因素，适宜的浓度可以使清除能力得到准确的评估。
五、应用领域羟自由基清除能力测定在抗氧化剂的筛选和评估中具有广泛的应用。
抗氧化剂可以通过清除羟自由基来减轻氧化应激引起的损伤，具有重要的保护作用。
因此，羟自由基清除能力测定可以帮助筛选出具有较强抗氧化能力的化合物，并为新药开发和保健品研究提供依据。
羟自由基清除率检测试剂盒(Fenton微板法)
羟自由基清除率检测试剂盒(Fenton 微板法)简介：在生命活动的代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟自由基·OH 是体内最活跃的活性氧，可介导许多生理变化。
羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病，如引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构和功能。
羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
Leagene 羟自由基清除率检测试剂盒(Fenton 微板法)又称羟自由基清除能力检测试剂盒或羟自由基检测试剂盒，其检测原理H 2O 2/Fe 2+ 通过Fenton 反应产生羟自由基，将Fe 2+氧化为Fe 3+，产生的亚磺酸与偶氮染料反应生成偶氮岚，以酶标仪测定吸光度，在一定范围内颜色深浅与产生的羟自由基成正比，求得标准曲线，通过分析捕获产生的羟自由基可计算出自由基清除率或清除能力。
该试剂盒主要用于测定植物组织、血清、血浆等样本中的羟自由基清除率或羟自由基清除能力。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 蒸馏水2、 实验材料：植物组织(芹菜、绿豆、玉米等叶片)、血液、组织样本等3、 研钵或匀浆器4、 离心管或试管5、 离心机6、 96孔板7、 酶标仪编号 名称TO1131 100T Storage试剂(A): OH Lysis buffer 500ml RT 试剂(B): OH Assay buffer 50ml RT 避光 试剂(C): H 2O 2基液 1ml RT 试剂(D): OH 显色液 100ml4℃ 避光 使用说明书1份操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取正常或逆境下的新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取，样品：OH Lysis buffer的比例，加入OH Lysis buffer后匀浆或研磨，室温静置，离心，上清液即为羟自由基粗提液，4℃保存备用。
羟自由基清除率测定方法
羟自由基清除率测定方法
1. 哎呀呀，你知道吗？有一种羟自由基清除率测定方法叫比色法呢！就好像我们通过眼睛看颜色的变化来判断一样，是不是很神奇？比如在做实验的时候，加入特定的试剂后，颜色一下子就变了，那就能知道羟自由基清除的情况啦！
2. 嘿，还有一种电子自旋共振法呢！这就好像是给羟自由基装上一个追踪器，能清楚地看到它们的动向和变化。
想象一下，在实验室里，我们能这么精准地捕捉到羟自由基的信号，是不是超厉害呀！就像警察抓小偷一样把它们都“逮住”呢！
3. 哇塞，化学发光法也是羟自由基清除率测定的好方法呀！这不就像夜晚的萤火虫一闪一闪地告诉我们它在哪里嘛！比如说当有物质能清除羟自由基时，那光芒就会减弱，多直观呀！
4. 哟呵！荧光分析法也很不错呢！它就像是一道光，照亮羟自由基的“踪迹”。
我们通过观察荧光的变化来了解羟自由基的清除效率，感觉自己就像个侦探一样在寻找线索呢！比如说在某个样品中加入特定试剂后，荧光发生了改变，那就是关键信息呀！
5. 哈哈，脉冲辐解法也能用来测羟自由基清除率哦！这就如同闪电划过，清楚地显示出羟自由基的状态呢。
就像闪电带来的瞬间光明一样，让我们能看清整个过程。
在实验中看到那些数据的变化，可有意思啦！
6. 哇哦！分光光度法也能担此大任呀！这就像用一个神奇的“眼睛”去观测羟自由基的世界。
我们按照步骤一步步操作，就能得到想要的结果啦。
比如说在特定波长下测量吸光度的变化，就知道羟自由基的清除情况如何啦！
我觉得这些羟自由基清除率测定方法都各有千秋，都为我们研究和了解羟自由基提供了有力的手段呀！。
羟自由基清除能力检测
羟自由基清除能力检测
羟自由基清除能力（Hydroxy free radical scavenging activity）是一种衡量物质抗氧化能力的重要指标。
目前有关羟自由基的分析测试方法主要有高效液相色谱法、化学发光法、荧光分析法、分光光度法等。
其中测定羟自由基清除能力最常用的是通过分光光度法测定样本抑制显色物邻二氮菲的吸光度的下降，从而反映样品清除羟自由基的能力。
测定原理为：
H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+ ，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测羟自由基清除能力。
此外，我们还提供其他氧化应激类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定羟自由基清除能力样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 羟自由基清除能力信息。
羟自由基清除能力检测试剂盒说明书 微量法
北京索莱宝科技有限公司羟自由基清除能力检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC1325规格：100T/96S 产品内容：提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体0.16mL×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入9.84mL 蒸馏水混匀，也可按比例现用现配，配好的试剂4℃保存一周。
产品说明：羟自由基是人体在新陈代谢过程中产生的对生物体毒性强、危害大的一种自由基。
它可以使组织中的糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质发生氧化，遭受氧化性损伤和破坏，导致细胞坏死或突变。
羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
H 2O 2/Fe 2+通过Fenton 反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe 2+水溶液中Fe 2+氧化为Fe 3+，导致536nm 的吸光度下降，样品536nm 吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。
自备实验用品：恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤：一、样品的制备：（1）组织样品的制备：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
（2）血清、果汁等液体样品可直接测定。
（3）提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如5mg/mL。
二、测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至536nm，蒸馏水调零。
2、操作表：在1.5或0.5mLEP管中分别加入下列试剂空白管对照管测定管试剂一（µL）505050试剂二（µL）100100100试剂三（µL）100100100充分混匀，防止颜色不均一。
羟自由基清除能力检测试剂盒说明书 可见分光光度法
羟自由基清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC1320规格：50T/48S 产品内容：提取液：液体55mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体0.16mL×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入9.84mL 蒸馏水混匀，也可按比例现用现配，配好的试剂4℃保存一周。
产品说明：羟自由基是人体在新陈代谢过程中产生的对生物体毒性强、危害大的一种自由基。
它可以使组织中的糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质发生氧化，遭受氧化性损伤和破坏，导致细胞坏死或突变。
羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
H 2O 2/Fe 2+通过Fenton 反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe 2+水溶液中Fe 2+氧化为Fe 3+，导致536nm 的吸光度下降，样品536nm 吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。
自备实验用品：可见分光光度计、恒温水浴锅、1mL 玻璃比色皿、低温离心机、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤：一、样品的制备（1）组织样品的制备：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
（2）血清、果汁等液体样品可直接测定。
（3）提取物（或者药物）可配制成一定浓度，如5mg/mL。
二、测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至536nm，蒸馏水调零。
2、操作表：在1.5mLEP管中分别加入下列试剂空白管对照管测定管试剂一（mL）0.150.150.15试剂二（mL）0.30.30.3试剂三（mL）0.30.30.3充分混匀，防止颜色不均一。
样品（mL）--0.15试剂四（mL）-0.150.15HO（mL）0.750.600.452混匀后37℃孵育60min。
基于DNA底物的体外羟基自由基(·OH)清除分析法
基于DNA底物的体外羟基自由基(·OH)清除分析法【简介】以前的脱氧核糖降解方法缺乏特异性、生物相关性，甚至缺乏可靠性。
在本研究中，我们描述了基于DNA损伤的新的羟基自由基（·OH）清除测定法。
我们选择2-硫代硫酸反应性物质（TBARS，λmax530nm）作为羟基介导的DNA损伤的生物标志物，系统分析了影响A530nm值的各种因素(特别是溶剂干扰).在此基础上，我们建立基于DNA损伤的体外羟基（·OH）清除分析的实验程序。
我们使用以上方法究成功测定了30种抗氧化剂，证明该法是可靠的、简单的，而且表述清晰，具有生物相关性，它适用于所有类型的抗氧化剂。
【图解】
【参考文献】Xican Li , Wenqiong Mai , Li Wang, Weijuan Han, A hydroxyl-scavenging assay based on DNA damage in vitro.Analytical Biochemistry,2013, 438 29–31。
羟基自由基清除能力的抗氧化能力评价 脱氧核糖法
羟基自由基（•OH）清除能力的评价：脱氧核糖法脱氧核糖法检测羟基自由基清除能力与溶剂影响【总流程图】脱氧核糖法评价（•OH）清除能力的总流程图图1 改进的脱氧核糖降解试验的操作过程[1]说明：脱氧核糖降解试验广泛用于评估羟基(•OH）食物或药物的自由基清除能力。
我们比较了在乙醇溶液中制备的25个抗氧化剂样品与去除乙醇（残留物）后制备的样品的羟自由基清除活性。
数据表明，乙醇溶液和残渣样品的测定结果相差约9倍。
这表明酒精的强烈干扰。
为了进一步研究其机理，用脱氧核糖法测定了18种有机溶剂（包括乙醇）的清除活性。
大多数纯有机溶剂（尤其是醇类）都能有效清除羟基自由基。
【实例】三种典型的抗氧化剂（含阿魏酸、槲皮素和褪黑素）的浓度响应曲线，在乙醇溶液和挥干乙醇后的对比。
这表明乙醇有严重干扰。
图2 阿魏酸的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）图3 槲皮素的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）图4 褪黑素（Melatonin）的浓度响应曲线（挥干乙醇和乙醇溶液的对比）【背景介绍及溶剂影响的原因分析】脱氧核糖降解试验自1987年建立以来，已广泛用于评估食品、营养素和药物的羟自由基清除能力。
在脱氧核糖降解试验中，通过芬顿反应获得•OH，随后，•OH攻击脱氧核糖并打破其环呋喃环，生成丙二醛（MDA）。
MDA与2-硫代巴比妥酸（TBA）结合，在530 nm处产生λmax的有色物质。
因此，A530nm值与生成的羟基自由基的量成正比，A530nm值越高，表明OH自由基水平越高。
如果添加抗氧化剂样品，A530nm值将降低，表明抗氧化剂清除了一些OH自由基。
这是脱氧核糖降解测定的原理。
与大多数生化分析一样，脱氧核糖分析需要在测量之前使用各种有机溶剂制备样品溶液。
然而，据观察，通常用于制备这些样品溶液的有机溶剂（尤其是醇类）可能会产生强烈干扰，而这些干扰往往被分析用户忽视。
几个研究小组明确表示，他们使用有机溶剂制备样品溶液，样品溶液直接用于脱氧核糖测定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
羟基自由基(·OH)清除能力测定法的简易操作图解
（适用于各种抗氧化剂）
文献来源
[1] Xican Li. Solvent effects and improvements in the deoxyribose degradation assay for hydroxyl
radical-scavenging. Food Chemistry, 2013, 141(3):2082-2088.
操作图解
图1 羟基自由基(·OH)清除能力测定法（脱氧核糖降解法）的实验操作图
具体方法
1 溶液配制
0.2 MKH2PO4溶液: 100mL蒸馏水+2.7218g KH2PO4。
0.2 M Na2HPO4溶液: 500mL蒸馏水+35.814g Na2HPO4·12H2O。
磷酸盐KH2PO4－Na2HPO4缓冲液phosphate buffer（0.2M, pH7.4, 100mL）：19mL0.2 MKH2PO4+ 81mL 0.2 MNa2HPO4. （注意：19：81是大概的体积比，具体的比例以pH=7.4为准）。
Na2EDTA溶液：（1mM, 25mL）：8.4 mg+25mL蒸馏水。
FeCl3溶液：（3.2mM, 5mL）：4.2 mg+5mL蒸馏水。
抗坏血酸溶液：（1.8mM, 50mL）：15 mg+50mL蒸馏水。
H2O2溶液：（50 mM,5mL）：30 mg 30% H2O2+5mL蒸馏水。
脱氧核糖溶液：（50 mM, 2 mL）：15 mg脱氧核糖+2 mL蒸馏水(该用量约可做40个数据) 。
三氯乙酸溶液TCA（10%, 10 mL）：1 g + 10 mL蒸馏水。
硫代巴比妥酸溶液TBA：（5%, W/V, 20mL）:取1gTBA+20mL蒸馏水+20mgNaOH (临用时配，超声溶解. 该用量可做40个数据) 。
样品溶液：选合适的溶剂（如甲醇、无水乙醇等），先配成1mg/mL的溶液试试。
2 操作方法与注意事项
2.1 操作方法（见图1）
2.2 注意事项
1 测试前，一定要检查试管是否干净，不净的试管不能用。
正式测试前,盛装样品的容器(小瓶或试管)
必须用铬酸洗液洗净。
2 样品溶液加入到试管后，先彻底挥干溶剂，再用样品的残渣，进行实验检测（见：操作图解）。
这一步至关重要，因为有机溶剂都会产生数十倍的干扰。
其原因中文献[1]已做详细说明。
3 最后显色时，如颜色太淡，可能是加热温度不够高；
4 加样：在10μL以下最好用进样针，插到瓶底；取样：力保均匀。
5 如平行样之间差别太大，系混合不均所致。
两次水浴前，都要充分振荡。
振荡时，用保鲜膜盖住管
口上下剧烈振荡。
3 计算公式
清除率00A -A
% = 100%A
4 实验结果（以咖啡酸Caffeic acid 为例）
采用文献[1]的改进方法，用样品残渣检测，消除了溶剂干扰，其结果如下图的黑线；如果不挥干溶剂（醇溶液），结果则为红线。
从IC 50值分析，相差10倍以上。
图2 咖啡酸的·OH 自由基的清除能力的对比（挥干溶剂vs 样品溶液）
致谢：本文由论文原作者广州中医药大学李熙灿教授提供，特此致谢。