羟自由基清除率测定.docx
抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率
（羟自由基清除试验）
采用Fenton试剂：过氧化氢/亚铁盐。
原理：H2O2与亚铁离子反应生成·OH,·OH自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（•OH）的多少，吸光度与羟自由基（•OH）的量成正比。反应体系中若加入羟自由基（•OH）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。
操作：
样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。将蔬菜汁或果汁放入50ml离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶土），在3000~ 4000rpm下离心10min~ 20min后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。
取25ml比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml1mmol/L硫酸亚铁溶液、5ml3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml样品溶液，空白管中加入1ml蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min后，用分光光度计在510nm的波长下测定各管的吸光度。以3mmol/L水杨酸溶液调零。
其对•OH自由基的清除率SA（%），可根据下式进行计算：式中：A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度
###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H2O2溶液，本底管中H2O2溶液用蒸馏水代替。
本底管和样品管分别加入1ml样品溶液，空白管中加入1ml蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L水杨酸溶液定容至刻度。在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min100A0A1-A0= SA(%)清除率后用分光光度计在510nm的波长下测定吸光度。空白管为A0，样品管为A1，本底管为A2。
其对·OH自由基的清除率SA（%），可根据下式进行计算：
清除率SA(%) =｛[(A0—(A1- A2) ]/A0｝×100[10]
式中：A0—不加样品的吸光度
A1—加入样品的吸光度
A2—本底的吸光度
ROS体外清除法、 羟基自由基体外清除法 (以DNA为底物的新方法)
以DNA为底物的体外羟基自由基（•OH）清除法
【文献依据】
[1] Li, X.; Mai, W.; Wang, L.; Han, W. A Hydroxyl-scavenging Assay Based on DNA Damage in vitro.
2013, 438. doi: 10.1016/j.ab.2013.03.014.
【操作图解】
图1 以DNA底物的体外羟基自由基（•OH）清除法的标准操作 [1]
说明：以前的脱氧核糖降解方法缺乏生物学相关性、特异性甚至可靠性。本研究描述了一种新的基于DNA损伤的羟自由基清除试验。选择2-硫代巴比妥酸反应物质(TBARS，λmax=530nm)作为羟基介导DNA损伤的生物标记物。在系统研究影响A530nm和溶剂干扰的各种因素的基础上，制定了实验程序。对30种抗氧化剂的成功测定表明，所提出的DNA损伤方法是可靠、简单、特异和生物学的相关的它适用于体外培养的所有类型的抗氧化剂。
【前言与实验原理】
羟基自由基(·OH)是活性最强的ROS（活性氧），可引起严重的生物后果，包括突变、细胞死亡、致癌和衰老。因此，清除羟基自由基在生物化学中起着重要作用。作为体外评价羟清除活性的经典方法，脱氧核糖降解试验已广泛应用于生物学和医学。然而，该方法缺乏生物学相关性、特异性甚至可靠性。[1]
在该方法中，通过芬顿（Fenton）反应获得羟基(•OH)。当羟基攻击分离的脱氧核糖时，它会断裂脱氧核糖的呋喃环生成丙二醛(MDA)。MDA与2-硫代巴比妥尿酸(TBA)结合，生成硫代巴比妥酸反应物(TBARS) ,λmax = 530 nm。因此，A530nm值可以反映羟基清除活性。这是该方法的原理。然而，该方法缺乏生物学和医学的相关性，因为人体中没有分离的脱氧核糖。
更重要的是，原来的脱氧核糖方法没有考虑有机溶剂的干扰。在我们的实验中，观察到乙醇溶剂（9.88倍）大大提高了五种参考抗氧化剂的羟基清除水平)。这表明有很强的溶剂干扰。如，咖啡酸、BHA在乙醇溶液与挥干乙醇时，其抑制率就有很大的差异：
体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结
体外抗氧化清除自由基能力测定方法总结
1 总还原力的测定
采用Lee等[14]方法,略修改.取1.0 mL浓度为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液,加入2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH 6.6),然后加入2.5 mL 1%六氰合铁酸钾(K3Fe(CN)6), 50℃水浴30 min后加入2.5 mL
10%的三氯乙酸,混匀1 500 g离心10 min,取上清液2.5 mL加2.5 mL水和0.5 mL
0.1%的三氯化铁混匀,于700 nm处比色测定.以25~200μg/mL维生素C为标准溶液做标准曲线,以维生素C相当含量(mg/g)表示样品总还原力.
2 DPPH·自由基清除率的测定
采用Yamaguchi等[15]方法,取0.2 mL浓度分别为25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL, 150μg/mL和200μg/mL的样液同1.0 mL 95%的DPPH乙醇溶液混匀,于37℃反应60 min后在517 nm处比色.DPPH自由基清除率用以下方程式计算:
Y= [(OD517对照-OD517样品)/OD517对照]×100
式中:Y为清除率,%;OD517对照为517 nm下对照品的吸光度值;OD517样品为517 nm下不同浓度样品的吸光度值.
3 羟基自由基(·OH)清除率的测定
桦褐孔菌多酚的羟基自由基(·OH)清除率由改动后的Nicholas Smirnoff[11]法测得。反应体系(4 mL)包括:1 mL H2O2(8.8 mmol/L),1 mL FeSO4(9 mmol/L),1
mL水杨酸(9 mmol/L),1 mL多酚溶液(0.4mg/mL)。H2O2最后加入以启动整个反应。反应体系在37℃条件下温育60 min,在15 000×g条件下离心6 min。在510
nm处检测吸光度,·OH清除率用以下公式计算:
清除自由基研究方法汇总
清除⾃由基研究⽅法汇总
电⼦⾃旋共振法（ESR）、⾼效液相⾊谱法、化学发光法、⽐⾊法、分光光度法
⾃由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的⾃由基，减轻它们对机体的损伤。⽬前常⽤超氧阴离⼦⾃由基体系（O2-·）、羟基⾃由基体系（·OH）、⼆苯代苦味酰基⾃由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除⾃由基能⼒进⾏了研究。
其中ESR法和⽓相⾊谱法、HPLC 法对⾃由基的检测灵敏度⾼，但对设备要求较⾼，操作复杂，⽆法在⼀般实验室普及。⽽
其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被⼀般实验室所采⽤，但测定过程中的⼲扰因素较
多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常⽤。
原理部分：
1.DPPH·法测试机理
DPPH·（⼆苯代苦味脐基⾃由基）的甲醇溶液呈深紫⾊，可见光区最⼤吸收峰为492nm。当⾃由基清除剂加⼊到DPPH·溶液
中时，DPPH·的单电⼦被配对⽽使其颜⾊变浅，在最⼤吸收波长处的吸光度减少，⽽且颜⾊变浅的程度与配电⼦数成化学计
量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价⾃由基被消除的情况。
2. 羟基⾃由基（·OH）
1）邻⼆氮菲法[70]
实验原理：邻⼆氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最⼤吸收峰，是⼀常⽤的氧化还原指⽰剂，其颜⾊变化可
敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产⽣羟⾃由基，邻⼆氮菲－Fe2+⽔溶液被羟⾃由
基氧化为邻⼆氮菲－Fe3+后，其510nm 最⼤吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟⾃由基清除剂，则Fenton 反应产⽣的羟
⾃由基将被此清除剂全部或部分清除，邻⼆氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这⼀原理，可建⽴以A510变化
反映⾃由基清除剂对羟⾃由基清除作⽤的⽐⾊测定法。
2）⽔杨酸法[71]
实验原理：羟⾃由基易攻击芳环化合物产⽣羟基化合物，因此可⽤⽔杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，⽣成的2,3－⼆羟基
羟基自由基的测定方法
羟基自由基的测定方法(总1页)
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--内页可以根据需求调整合适字体及大小-- 羟基自由基(.OH)是最活跃的一种活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，几乎可以与所有的生物分子、有机物或无机物发生各种不同类型的化学反应，并伴有非常高的反应速率常数和负电荷的亲电性。羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使细胞坏死或突变，羟基自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关。羟基自由基由于其寿命短，反应活性高，存在浓度低，目前尚未有专一、有效的方法可以精确测定羟基自由基的含量，其测定方法也成为一项国际性的难题。本文对近几年出现的羟基自由基检测方法进行了综述。
1电子自旋共振法
电子自旋共振法或电子顺磁共振法主要研究对象为未成对的自由基或过渡金属离子及其化合物。自旋捕捉(spin trapping)技术的出现为化学反应中自由基中间体及生命活动过程中短寿命自由基的检测开辟了新的检测途径[[1]]。此方法是利用捕捉剂与自由基结合形成相对稳定的自旋加合物(spin adducts)，然后进行ESR测定。
2HPLC法
HPLC法可用于间接测定自由基。测定过程中必须先选择合适的化合物捕集被测体系中的 自由基，使之生成具有一定稳定性，且能被液相色谱 分离与检测的产物，然后用HPLC进行测定。1）、 采用二甲基亚砜捕集羟基 自由基的HPLC测
2）、采用水杨酸捕集羟基自由基的HPLC测定方法
3化学发光法
化学发光法是一种灵敏、准确的检测自由基的方法，其原理是利用发光剂被活性氧自由基氧化成激发态，当其返回到基态时放出大量光子，从而对发光起放大作用。且自由基产生越多，发光值就越大。通过函数换算间接反应系统中自由基的量。与ESR和HPLC法相比，具有操作简便、设备成本较低、测定快速等优点。
OH.的清除能力(邻二氮菲一Fe2+比色法)
。OH的清除能力（邻二氮菲一Fe2+比色法）
一、测定原理
邻二氮菲—Fe2+是常用的氧化-还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态改变。H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生·OH（H2O2 + Fe2 + =·OH+OH- + Fe3
+），邻二氮菲-Fe2+水溶液可被经自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+，从而使邻二氮菲-Fe2+在510nrn处的最大吸收峰消失（或降低）。
二、测定方法
1.试剂配制
（1）7.5mM邻二氮菲溶液：取邻二氮菲（orthophenanthroline，1,10-phenanthroline monohydrate，C12H8N2·H2O，FW198.22）1.487g，溶于10.00mL无水乙醇中，使用时用重蒸馏水稀释100至100mL。
（2）0.05M pH7.4 PBS。
（3）7.5mM硫酸亚铁溶液。
（4）0.1% H2O2。
取3支10mL比色管, 分别依次加入1mL 7.5mM邻二氮菲溶液、2mL pH = 7.4 PBS
缓冲溶液、1mL7.5mM硫酸亚铁溶液，在2、3号比色管中各加入1mL 0.1% H2O2 , 然后在3号比色管中加入1mL提取液，用重蒸馏化水定容至刻度，在37 ℃的水浴中反应1h ，在510 nm波长测吸光度值，计算羟自由基的清除率。重复三次。
·OH清除率( %) =（A样品— A损）/（A未损— A损）×100
式中：A样品—缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲+样品+ H2O2
A未损—缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲
A损—缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲+ H2O2
Hydroxyl free radical scavenging activities：The scavenging activities of hydroxyl free radical were
assayed by a modified Fenton reaction protocol (Caillet et al., 2007). The assay system consisted of 1.4
分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基
文章编号:1000-2375(2002)04-0326-03
分光光度法测定Fenton反应产生的羟自由基
刘立明,刘丽虹,宋功武,方光荣
(湖北大学化学与材料科学学院,湖北武汉430062)
摘 要:建立一种甲基紫作显色剂分光光度法测定Fenton反应产生的・OH的方法,所产生的羟自由基与甲基紫作用后使其吸光度降低,利用吸光度值的变化可间接测定所产生的羟自由基,确定了体系最佳实验条件.同时测定抗氧化剂清除羟自由基的实验,证明该体系可作为筛选抗氧化剂的方法之一.关键词:分光光度法;甲基紫;羟自由基中图分类号:O656.9 文献标识码:A
收稿日期:2002-04-18基金项目:中国分析测试基金资助作者简介:刘立明(1969- ),男,硕士生1 引 言
羟自由基(・OH)是一种氧化能力很强的自由基,它能够很容易地氧化各种有机物和无机物,氧化效
率高,反应速率快,是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧,与机体的衰老、肿
瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关.由于・OH的反应活性大、寿命短、存在浓度低,所以关于・OH的检测方法
就显得特别重要.近年来,国内外文献报道了检测羟自由基的主要方法有:电子自旋共振法[1]、高效液相色谱法[2]、化
学发光法[3]、比色法[4]、光度法[5]等.电子自旋共振法和高效液相色谱法操作复杂,仪器昂贵,化学发光
法虽然操作简便,测定快速,但其仪器普及不广.我们采用甲基紫作显色剂分光光度法测定Fenton反应
产生的・OH,该法仪器简单,操作简便,测定快速,适于广泛使用.
2 实验部分
2.1 仪器与试剂 λ-17紫外-可见分光光度计(美国P-E公司);PHB-4型酸度计(上海雷磁仪器
厂);过氧化氢溶液(1%):取30%的过氧化氢溶液1.0mL,用水定容100mL容量瓶;甲基紫溶液(2.06×10-3mol・L-1):称取0.2032g甲基紫用水定容100mL容量瓶,使用时稀释成不同浓度溶液;Fe2+溶
法对天然抗氧化物质抗羟自由基性能的测定
法对天然抗氧化物质抗羟自由基性能的测定
闫有禄
（云南省红河学院理学院化学系2001级化学教育化教AB班蒙自661100）
摘要：为了检测Fenton试剂（H2O2/Fe2+体系）产生的羟自由基（.OH），本文采用了亚甲基蓝和邻二氮菲―Fe2+两种分光光度法对六种天然的野生植物抗氧化剂对羟自由基的作用进行了分析和检测。两种分光光度法对羟自由基的分析检测及抗氧化剂的抗羟自由基性能检测方法，对研究工作都具有很好的实用性。从茶叶、黄草、甘草、葛根、姜、枇杷籽中提取的抗氧化物质与羟自由基清除率具有明显的量效关系，具有很好的抗氧化能力及羟自由基清除作用，方法稳定性好，操作简便，测定快速，能简便的筛选抗羟自由基的清除率和有效抗氧化剂药物的方法。
关键词：羟自由基、羟自由基检测、分光光度法、自由基清除率、抗氧化作用、抗氧化剂。
引言：
羟自由基是体内最活泼的活性氧，是一种氧化能力很强的自由基，是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可导致许多病理变化，它可以通过电子转移、夺取氢原子（加成）和羟基化（脱氢）等反应方式与生物体内的多种分子作用，在生物体内，需氧代谢的氧化还原反应所产生的羟自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构及功能，使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等都发生氧化，使物质的氧化性遭受损伤和破坏，造成细胞坏死或突变。同时羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基的检测对于自由基的生物作用研究有重要意义。羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标，因此，加强对羟自由基作用的研究是很有必要的。产生羟自由基的方法除经典Fenton反应外，还有Cu+―H2O2、Co2+―H2O2体系也能产生羟自由基，只是它们的最大吸收波长不同。目前分析检测羟自由基的方法有电子自旋共振法、化学发光法、脉冲辐解法、细胞色素C氧化法、无机荧光法、高效液相色谱法、薄层扫描法等。采用这些方法时所需仪器特殊，试剂昂贵，因而使其应用受到限制。本文采用两种不同的分光光度法进行羟自由基的产生及物质的抗氧化性能进行分析、检测和研究。天然物质抗氧化作用的研究及抗氧化剂的开发目的就是为了清除自由基，使生物体能够健康生长和发展。此两种分光光度法由于所需设备简单、仪器通用、操作简便、快速，便于广泛应用。 1、 实验部分六种天然植物中抗氧化物质的提取： 1.1实验部分
抗氧化性检测(羟基自由基、普鲁士蓝)
d.还原能力的测定
采用普鲁士兰法。分别精密吸取各组分浓度为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mg/mL的多糖及Vc
溶液2mL，加入0.2mol/L pH=6．6的磷酸盐缓冲液2.5mL及1%铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，于50℃水浴加热20min后迅速冷却，再加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，混匀后吸取2.5mL溶液于比色管中，加蒸馏水2.5mL和0.1%氯化铁溶液0.5mL，常温反应10min后于700nm处测定吸光值，吸光值越大，表明还原能力越强。
a.清除羟基自由基活性的测定
采用水杨酸法。在10mL试管中依次加入9mmol/LFeSO4溶液2mL，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL和各组分浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的多糖或Vc溶液2mL，8.8mmol/LH2O2溶液2mL。充分混匀后于37℃水浴30min，于510nm处测定吸光值A，以加蒸馏水为空白对照，做三次平行试验。用以下公式计算对羟基自由基的清除率：
R=[Ao-(Ai-Aj)]/Ao×100%(2-10)
式中，Ao表示加入蒸馏水空白体系的吸光值；
Ai表示为加入不同浓度样品溶液后测得的吸光值。
Aj表示水代替H2O2时不同多糖浓度下测得的本底吸光值。
取7支试管依次加入1.8 mmol/L FeSO4 1.0mL、1.8mmol/L水杨酸 0.75 mL、0.3% H2O2 0.5mL摇匀，分别向7支试管中加入10 mg﹒L-1多糖溶液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，再补水至0.5mL，摇匀，37℃水浴30 min，以双蒸水为参比测其510nm处吸光度Ax。空白实验：0.5 mL双蒸水取代多糖溶液，重复上述过程，测吸光度A0 ；对照实验：用0.5 mL双蒸水取代H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度As；用蒸馏水分别取代多糖溶液和H2O2溶液，重复上述过程，测吸光度As0 。样品对羟自由基的清除率计算见式（1）。
柑橘和瓯柑橘皮类黄酮清除羟基自由基的效果
柑橘和瓯柑橘皮类黄酮清除羟基自由基的效果
张静
【摘 要】Flavonoids extracted from orange peel and citrus suavissima peel
was applied as the object in this study.A method was developed for
determination of the hydroxyl radical in Fenton reaction. Bromocresol
purple reacted with · OH, then the absorbency of the solution declined. It
can be used to determine the ·OH indirectly due to the change of
absorbency. The results showed that lmg/mL flavonoids from orange peel
increased from 0.2mL to 0.8mL, lmg/mL flavonoids citrus suavissima peel
from increased from 0.1mL to 1.0mL on the scavenging effect of ·OH is
proportional to the increased （ P 〈 0.01）, and are respectively in 0.8mL
and 1.0mL on the removal rate reaches a maximum, and then began to
decline. The scavenging effect of ·OH from citrus suavissima peel was
significantly higher than that from orange peel in the same dose.%以柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮为研究对象，利用Fenton反应产生的羟自由基与染料试剂溴甲酚紫发生氧化反应后使其吸光值降低，间接测定它们对羟自由基（·OH）的清除效果。结果：lmg／mL柑橘皮类黄酮，在0．20-0．80ml的使用剂量范围内，对·OH清除效果呈正比增加趋势（P〈0．01），超过O．80ml后开始略有降低；lmg／mL欧柑橘皮类黄酮，在0．10-1．0ml的使用剂量范围内，对·OH清除效果也呈正比增加趋势（P〈0．01），超过1．0mL后开始下降。同等剂量下瓯柑橘皮类黄酮对·OH清除效果显著高于柑橘皮类黄酮。
[能源化工]清除羟基自由基试验
清除羟基自由基试验
1.1 溶液和试剂： 番红溶液，磷酸缓冲液,
1.1 溶液的配置：520 μg/ml番红溶液；6％H2O2溶液；0.2 mol/LPH值为7.4的磷酸缓冲液，EDTANa2-Fe2+溶液：准确称取0.0168 g EDTA
和0.0608 g FeSO4混合后溶解，定容到100 mL.
1.2 清除羟基自由基试验 在反应体系中加入磷酸缓冲液1.0 mL，番红0.2 mL，
EDTANa2-Fe2+溶液1.0 mL，再加入不同的植物提取物溶液7.0 mL，最后加入H2O20.8 mL，混匀后于40 ℃水浴保温30 min，在波长520
nm处测吸光度Ａ值。空白组以等体积的重蒸水代替样品溶液；对照
组以等体积的重蒸水代替样品溶液和EDTANa2-Fe2+溶液。
清除率E==（A样品－A空白）/（A对照－A空白）×100％
1.3 单因素试验 番红溶液。控制其他条件不变，分别配置560、540、500、480
四种溶液，进行试验，测定清除率E。绘制浓度和清除率E的曲线。
H2O2溶液。控制其他条件不变，分别配置2%、4%、6%、8%、10%四种溶液，进行试验，测定清除率E。绘制浓度和清除率E的曲线。
EDTANa2-Fe2+溶液：控制其他条件不变，分别在实验中加入EDTANa2-Fe2+溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，进行试验，测定清
除率E。绘制浓度和清除率E的曲线。
磷酸缓冲液: 控制其他条件不变，分别配置7.1、7.2、7.3、7.5、7.6五不同ＰＨ值的磷酸缓冲液，进行试验，测定清除率E。绘制浓
度和清除率E的曲线。