抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则

摘要:

几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体（anti-drug antibody ，

ADA反应,抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应.在人体内，抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质，抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应，包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明,抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性，以及将实验结果与临床事件联系起来,在临床前研究和临床研究中，很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要，并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限，特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此，本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子，旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。

1．简介:

生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸,一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达，比常规的小分子药物更大（一般大于1～3KD）。由于以上特性，生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素(种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂）、外在因素(给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法）相关.

抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状, 包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使

药物的的疗效发生改变）。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指标，这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的.因此，美国食品药品监督管理局以及

欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均要求通过药理学或毒理学相关的方法对抗药抗体进行评估. 免疫原性与临床症状之间的相关性的研究依赖于临床前研究和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征。因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当的开发及验证。已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的策略、方法开发及优化等方面的指南.方法学验证是对分析方法的评价, 通过特定的实验室方法表明采用的分析方法适用于相应的检测要求. 具体到抗药抗体的检测方法，验证就是指证明该方法能可靠的（例如一致性和重复性）在复杂的生物基质（血清或血浆)中检测出低量的药物特异性抗体。方法学验证应该通过预先研究阶段和研究阶段两个阶段进行，预先研究阶段是指在分析样品之前的工作，研究阶段是指样品的分析工作，预先研究阶段和研究阶段对于表明分析方法的有效性和可控性同等重要. 本文主要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的主要性能特征，推荐方法学验证相关的方法和措施。本指南应当被视为最佳实践范例，考虑到具体实际分析方法时，在保持科学合理性和客观性的情况下，也可以采取替代方法. 若采用替代方法，建议与监管机构进行充分讨论。以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导的免疫分析不在本指南的讨论范围内.

2. 方法

2.1 抗药抗体检测

临床和非临床研究通常是通过对治疗引起的抗药抗体反应的检测和表征来评估药物的免疫原性. 目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测, 包括酶联免疫法（ELISA)、放射免疫检定法（RIA)、放射免疫沉淀法（RlPA）、表面等离子体共振（SPR、电化学发光法（ECL。每一种检测方法均有其优点和局限性，在最近的文章中已进行过讨论［8,14] 。不管是采用何种方法，在方法开发和优化后均应进行正式的方法学验证，以保证该方法适合相应的检测要求。因此可以预测，本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测。研究人员应根据检测系统的特点确定合适的方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体的检测和表征通常包括四种不同类型的方法。抗药抗体检测试验通常包括筛选试验和特异性确证试验，表征试验通常包括抗体滴定和中和抗体检测[10］。应用到具体研究样本时，抗药抗体分析试验需要两个关键决策参数，分别为筛选试验的筛选临界点（screening cut point ）和特异性确证试验的特异性临界点（specificity cut point )。筛选临界点有助于抗药抗体检测结果的分类，高于筛选临

界点为活性样品(活性样品通常为潜在阳性样品），低于临界点为无活性样品。活性样品通过特异性确证试验（如竞争性药物抑制信号通路）检测是阳性（特异性活性)还是阴性(非特异性活性）。特异性临界点为抑制信号通路所需的样品量，也就是具体药物的抗药抗体，需要通过试验确定.

抗药抗体的检测方法通常是非定量试验（有时是半定量试验) ，因为没有可用的标准化的物种特异性的抗药抗体作为校正标准品[15] 。阳性对照一般都是内部开发的（例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体），不可能将受试者检测到的所有抗药抗体作为阳性对照。如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平，那应该证明标准品和试验样品的平行性，以确定样品的浓度的准确性[8，10］。若未证明样品与标准品间的平行性, 则准确性是可疑的. 滴定法是另一种评估抗体水平的方法，该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性. 然而,值得注意的是已有研究表明,滴定法适用于抗体水平的评估。几十年来，临床上感染、自身免疫疾病的诊断和治疗以及预防接种等都采用这一方法［16~22］。滴定法比较抗药抗体反应

更为简便且所需的验证工作更少，因为其不需要再对不同产品的抗药抗体与标准品间的平行性进行详细描述与证明。此外质量单位法每当标准品品改变时均需要进行重新验证。综上所述，两种方法都无法提供准确的定量数据。因此，赞助商建议采用相对浓度（质量单位）或滴度表示抗药抗体水平。某些监管机构会更倾向于使用滴度单位。滴度是仍能产生阳性结果的最大稀释倍数的倒数.

在方法的开发和优化阶段，应先确定方法并进行记录，例如选择所需的试剂、最佳浓度、预期样品所需的最大稀释倍数等。这些需要研究人员在预先研究阶段进行简单或重复确证。本文假定以下属性在验证之前已被确证: 免疫分析方案及方法设计，分析基质的类型,最大稀释倍数（MRD、试剂的最佳浓度、酶标板的均匀性评估（如位置的影响、漂移等）.监管机构可能会要求提供相关的数据

支持.在方法的开发和优化阶段, 通过对对照品的检测，对方法的变异性有一个初步的认识。

2.2 统计学的应用

降低验证过程中的主观作用是本文的重点之一. 为了确保实验的客观性必须依靠于统

计手段. 由于大多数研究者无法获得统计学家的服务，本文提供了简单且足够严格和有效的统计学方法。所涉及的统计计算都可以采用商业统计软件进行计算，计算过程不需要经验丰富的统计学家。然而，如果有统计学家协助进行验证实验设计和数据处理的话，统计学的应用可能会比本文提供的更为严格和有效.

3. 预研究验证

临床和非临床研究中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研究验证, 它主要从数学和可定量方面描述分析方法的性能特征[8］。预验证(prevalidation) 是指研究工作启动前的筹备工作，两者不能混淆。另一方面，在研究验证是指监控整个方法使用过程的性能特征，以确保方法的有效性和数据的可靠性。通过完整的方法开发和优化后，分析方法应具备验证的条件, 如优化试验数据表明检测方法具有潜在的可靠性和适用于相应的检测要求. 方法的可靠性依赖于分析设备和计算机系统的正常运转以及试验人员的熟练程度.本质上，

分析方法是包含多个因素的整体系统而不仅仅是试剂而已。验证方法应包括系统适用性，这属于在研究验证范畴。

建议开始预研究验证之前制定相应的验证实验方案或验证实验标准操作程序(SOP ，验证实验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的详细说明、待验证的性能特征以及精密度、稳健性、稳定性和耐用性的预期验收标准。此外建议在验证实验方案中加入适当的实验细节和数据处理步骤，这样可以为验证人员提供一个明确的指导以确保更好的处理数据。

抗药抗体检测应建立相应的验收标准, 有助于确保在研阶段的试验的有效性。为此,应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的系统适用性标准（可接受范围）。此外，在研验证阶段中间精密度试验，对照品和样品检测也应有相应的验收标准. 当在研验证阶段的分析数据不符合验收标准时，应拒绝该数据. 在预研验证阶段不应建立验收标准，因为这可能会使某些验证数据被排除，导致不能准确估计分析误差。除了可明原因（如技术误差）、有意或无意偏离实验方案所得分析数据应被剔除外，预研阶段的所有分析数据都应计算在内。目前，美国食品药品监督管理局（FDA、国际协调会议(ICH）和美国药典的指导性文件阐述了定量检测的分析验证应研究的一般性能特点[23~25] .由于

抗药抗体免疫分析属于半定量检测，所以有些要求并不不适用. 对于抗药抗体免疫分析方法学验证，应对以下9 项参数进行测定：

1. 筛选临界点

2. 确证临界点

3. 灵敏度*

4. 系统适用性控制（QCS验收标准

5. 耐药性*

6. 精密度

7. 鲁棒性

8. 稳定性＊

9. 耐用性（有条件时）

如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录，在预研验证阶段不需要对以上标有＊的参数进行重复验证, 尽管验证报告中应提供相关的数据。如果最终的方法有所变动的话，预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段的预期用途和产品上市后的用途可能会不同. 例如，在开发早期只有一个分析人员进行试验，开发工作完成后和上市后可能会有多个分析人员进行试验。整个产品生命周期的验证要求应随着检测方法应用的改变而改变.然后，在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证。

传统分析方法的稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。当使用滴度标示抗药抗体反应时, 需要使用阳性对照，或者最好使用累积抗药抗体阳性样品, 在合理稀释范围内不出现异常非线性。通常,在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度

（MRD的选择，验证阶段不需要进行重复测定。如果出现前带效应,建议选择一个不受前

带效应影响的MRD或者采用多种稀释样品。稀释线性信息有助于设计系统适应性质量控制。

3.1 筛选临界点

筛选临界点定义为筛选试验的响应水平，响应值高于该临界点的样品为活性样品（或者称为潜在阳性），响应值低于该临界点的样品为阴性样品。一个有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性的统计分析确定，所使用的样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者。

当免疫分析的方法存在错误风险时，筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴性[8，10］.如果筛选试验中不能识别出活性样品, 应怀疑该方法检测低阳性样品的能力。约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性，从而保证可以检测出低阳性样品[8] 。在实践中，假阳性结果总比没有阳性结果好 (如假阳性率可能不等于5％)。

3.1.1 筛选临界点的类型

可以应用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种: 固定临界点、浮动临界点、动态临界点。

（a）固定临界点：

预研验证阶段确定固定临界点，然后应用于在研验证阶段。固定临界点用于测试样品的分析，直到需要重新验证或改变（如测定方法发生关键变化、转移到另一个实验室进行试验或仪器升级等） .固定临界值在一个目标人群的同一研究中或多目标人群的各研究间是固定的。当预研究阶段的整个试验的均值相等、方差齐性时，采用固定临界点.

（b）浮动临界点

浮动临界点有两种计算方法，分析过程中数据需要进行对数(LOg)转换时，通过预研阶段确定的特定归一化因子乘以在研阶段的生物背景计算而得; 分析过程无对数转换时，计算方法归一化因子加上生物背景，生物背景可以由阴性对照（由样品的基质组成，抗药抗体反应为阴性) 、分析稀释剂或预处理受试者样品（个体特异性临界点）标示。浮动临界点可以是每一次试验每一块板（每一次试验中的若干块板）所特有的或每一个受试者

所特有的（使用受试者的预处理/基

线样本结果）。如果采用个体特异性临界点，需要在同一块板上检测预处理样品和处理后样品（或至少在同一试验中检测）。由于浮动临界点的确定过程需要对预研究验证的数据进行方差估计，所以不同试验间的结果应表现出方差齐性。采用阴性对照进行归一化时, 应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质样品的结果，例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在整个试验中是相关联的。如果均值相关，阴性对照均值适用于计算浮动临界点。如果均值不相关, 则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理.

（C）动态临界点、

同一试验的不同板之间、同一研究的不同试验间或不同研究间的动态临界点均不同.动态临界点的确定不需要预研究阶段的方差估计. 这一特征将动态临界点和浮动临界点区别开来。只有当不同试验间的结果方差有显著性差异时，才使用动态临界点. 实际使用时, 动态临界点的限制性因素是每次试验都需要大量的样本数才能确定临界点。建议优先采用固定临界点或浮动临界点。如果试验间的均值或方差存在差异，建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查.例如，若果差异来源于分析员或设备，则采用分析员或设备的固定临界点或浮动临界点

代替动态临界点。因为动态临界点是一种不常见的非常规方法，建议谨慎制定该临界点，最好能与监管机构进行充分沟通.

3.1.2 评估临界点的样品

建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估. 有时候需要在开始预研究验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的, 甚至是不可能的。因此,一般从药物初治健康受试者的样本中进行评估，并确立一个起始临界点。该方法适用于于临床I 期的研究。当临床研究开展到临床II 期以后，便可得到目标疾病患者的样本, 应该对不同的目标人群重新评估临界点。如果目标人群和正常志愿者的响应值的平均值和方差相当，可以使用同一个临界点。如果没有可比性,则需要采用目标疾病特异性的临界点。

为了确定临界点，在验证阶段应分析足够数量的样本，这样才能对生物和分析变异进行有效的统计学评估。通常在临床研究中，需要分析超过50 个独立受