纸片法(KB)药敏实验原理及实际操作方法
药敏试验的步骤
药敏试验的步骤药敏试验药敏纸片法药敏纸片法是最常用的一种试验方法,能直接体现出抗菌药物的抗菌效用,其优点是：直观明显,对比鲜明，有一定的实验依据。
缺点是：仅表现体外抗菌效果,由于抗菌药物在体内受体液环境,代谢分布,组织扩散浓度,半衰期等因素的影响,个别药物并不能真实反应出实际的抗菌疗效。
下面介绍抗菌药物的药敏纸片法。
试验材料经分离和鉴定后的纯培养菌株(例如大肠杆菌、链球菌等),营养肉汤,琼脂平皿,棉拭子,镊子,酒精灯, 药敏纸片若干。
1.1药敏纸片的制作方法将要试验的抗菌药物按其有效浓度稀释成1mL备用，脂溶性的抗菌药物使用乙醇或丙酮溶解。
用打孔器将滤纸打成6mm直径的圆片100张高压灭菌，加入到抗菌药物有效浓度1mL稀释液中充分混合，阴凉处干燥备用。
多种联合的抗菌药物制剂以其成分中某种含量最高的抗菌药物为标准稀释成有效浓度。
抗菌中草药药敏纸片的制作：取中草药粉剂1g加适量的水充分浸泡煮沸，滤液浓缩成1mL，也加入100张纸片干燥备用。
1.2药敏试验的操作步骤1.2.1 取自然发病动物的病料心血、脾、肝脏、淋巴结或病变明显的组织无菌操作接种鉴别培养基37℃分离培养24h，选典型菌落备用。
1.2.2 将病料中分离出的病原菌用密集划线法或涂布法接种至专用琼脂平板培养基上，均匀的粘贴各药敏纸片，并记录每种抗菌药物药敏纸片的位置。
1.2.3 37℃培养12～18h，取出观察结果。
1.3判定结果1.3.1 量取各药敏纸片抑菌直径大小，并仔细观察抑菌圈的清晰度,通常直径小于10mm的判为该抗菌药物为低度敏感,10～15mm之间为中度敏感，15～25mm为高度敏感，25mm以上为极度敏感。
1.3.2 抑菌圈边缘分界清晰，内部洁净透明,说明该抗菌药物作用迅速，多半为杀菌剂；边缘十分清晰，内部朦胧说明该抗菌药物可能是慢效抑菌剂或有耐药的产生，或分解较快维持抗菌时间短。
1.3.3 抑菌圈中分层次形成同心年轮样，说明可能是联合使用抗菌药物或该抗菌药物失效过快或细菌产生了耐药性。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法是一种常用的检测细菌对抗生素敏感性的方法，其操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如Mueller-Hinton（MH）琼脂（常用于细菌药敏试验）。
按照制造商的
说明溶解固体培养基，并加入适当量的琼脂（通常为2%），
将其加热溶解，然后用无菌盘口装好。
2. 菌液制备：从培养基上的细菌菌落中接种一根病菌棒，将其浸入含有3-5毫升无菌盐水的试管中。
3. 菌液浓度调整：将试管中的细菌菌液用比例稀释至合适的浓度（通常为0.5麦克百尼尔/毫升）。
4. 纸片扩散：用无菌的棉签将稀释后的菌液均匀地涂抹在一块布拉格琼脂平板上，然后在琼脂上按要求摆放敏感纸片（一般为阿莫西林、头孢菌素等常用抗生素），注意要与纸片相距一定距离。
5. 培养：将布拉格琼脂平板反面朝上，用无菌培养皿盖好，然后放入恒温培养箱中进行孵育。
通常在35-37°C条件下培养
24小时。
6. 结果录入和解读：观察纸片周围的细菌生长情况，通过测量纸片周围形成的抑制圈直径来评估细菌对不同抗生素的敏感性。
根据抑制圈的直径大小，将细菌的敏感性分为敏感、中等和耐
药三个等级。
注意事项：
- 操作过程需要严格无菌，以免细菌的外源污染影响结果。
- 确保培养皿紧闭，避免细菌的空气传播。
- 操作前后要做好清洁，避免微生物交叉感染。
- 移栽过程要注意避光，避免紫外线对细胞的破坏。
kb法药敏试验流程
kb法药敏试验流程KB法药敏试验是一种常见的药物敏感性检测方法，它可以用来检测细菌对不同抗生素的敏感性。
这种方法可以帮助医生选择最有效的治疗方案，从而提高治疗效果，减少药物滥用和耐药性的发展。
KB法药敏试验的流程大致如下：1. 培养细菌首先需要从患者样本中分离出病原菌，并在培养基上进行细菌培养。
通常会选择含有营养物质丰富的琼脂培养基，让细菌在其中生长繁殖。
2. 制备药物接下来需要准备不同种类的抗生素药物。
这些药物可以是单一的化合物，也可以是混合物。
通常会选择一些常用的抗生素，如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类等。
3. 稀释药物为了确定细菌对不同浓度的药物的敏感性，需要将药物进行稀释。
通常会选择两倍稀释法，即每次将药物浓度减半，直到得到一系列不同浓度的药物。
4. 加入细菌将不同浓度的药物加入到含有细菌的琼脂培养基上，并在恒温箱中进行培养。
通常会选择37℃左右的温度，让细菌在其中生长繁殖。
5. 观察结果观察不同浓度的药物对细菌生长的影响，可以通过肉眼或显微镜进行观察。
如果药物浓度过低，细菌可以正常生长；如果药物浓度过高，细菌无法生长；如果药物浓度适中，细菌可以生长但速度较慢。
6. 计算MIC值MIC（最小抑菌浓度）是指能够抑制细菌生长的最低药物浓度。
通过观察不同浓度药物对细菌生长的影响，可以确定MIC值。
通常会选择MIC为药物敏感性的判断标准，MIC值越小表示细菌对该药物越敏感。
总之，KB法药敏试验是一种简单而有效的药物敏感性检测方法。
通过这种方法可以快速、准确地确定细菌对不同抗生素的敏感性，为医生选择最佳治疗方案提供了重要依据。
纸片扩散法药敏试验原理
纸片扩散法药敏试验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠纸片扩散法药敏试验原理这档子事儿。
你说这药敏试验就像是一场细菌和药物的大作战！咱得想办法知道哪种药物能把那些捣乱的细菌给收拾得服服帖帖呀。
想象一下，咱把含有药物的小纸片就像一个个小战士一样，整整齐齐地放在涂满了细菌的培养基上。
这些小纸片就开始发挥它们的魔力啦！药物会从纸片里慢慢扩散出来，就像孙悟空画的那个圈圈一样，形成一个药物浓度逐渐变化的区域。
这时候细菌们可就面临考验啦！有的细菌比较弱，一碰到稍微厉害点的药物浓度就不行啦，直接被打败，这周围就变得干干净净，没它们的影儿啦。
可有的细菌比较顽固，还能在药物浓度不那么高的地方顽强抵抗呢。
这不就跟咱生活中一样嘛，遇到困难有的人一下子就被打倒了，有的人还能撑一会儿。
那通过观察这些小纸片周围细菌的生长情况，咱不就清楚哪种药物对这些细菌最有效啦！这多重要啊，就像医生治病得找对药一样，不然那不就白折腾啦！
你看，这纸片扩散法药敏试验不就是这么个道理嘛！它就像是一个神奇的魔法，能帮我们找到制服细菌的法宝。
而且操作起来也不难呀，只要咱细心点，按照步骤来，就能得到准确的结果。
咱可别小瞧了这个试验，它可是为了咱的健康保驾护航呢！医生们能根据这个结果来给病人开药，让病人能快点好起来。
这就像是在黑暗中找到了一盏明灯，给人指明了方向。
所以啊，这纸片扩散法药敏试验原理真的是太实用啦！它就像一个默默无闻的英雄，在背后为我们的健康默默付出呢！大家说是不是呀！。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上依照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后丈量抑菌圈大小，并根据相关解释尺度进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录. 1 试验原理. 2 试验步调. 3 结果分析. 4 注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步调1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包含流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂概况，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边沿涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收概况多余的水分，但放置时间不该超出15分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS) 推荐的 K–B 琼脂法进行。
本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。
用无菌棉拭子蘸取已经校正的 0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个 MH 培养基表面，每次将平板旋转 60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。
待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。
每个平板贴 5 张纸片，纸片间距不少于 24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm。
在菌接种后 15 min内贴完纸片。
将平板反转，37℃恒温孵育 18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。
抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
每次药敏试验用大肠杆菌ATCC25922 和金黄色葡萄球菌ATCC25923 做质控。
药敏判读标准根据 CLSI 标准 (2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表 5-2）[84]。
表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确
性
Table 5-2 Disc diffusion test － according the admissible range of quality-control strain’s inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics
susceptibility test (mm)
抗菌药物纸片含药量
（µg）
抑菌环直径(mm)
S I R
大肠埃希菌
ATCC25922
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37 KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药。