纸片法 KB 药敏实验原理及实际操作方法
药敏试验方法
药敏试验方法药敏试验方法：K-B法：1 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成0.5麦氏单位。
2 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。
3 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。
4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。
每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。
每个纸片中心间距24mm。
纸片一旦与平板接触，不应再移动。
5 贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。
嗜血杆菌属，链球菌属放入3%-5%的CO2烛缸。
6 孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS手册比较，作出结果判断。
说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。
链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B 法.肺炎链球菌胶乳凝集测定法1. 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。
2. 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。
3. 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。
4. 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。
5. 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。
注：R3为阳性对照。
药敏纸片的选择1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头孢噻肟（CTX）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢呋辛（CXM）庆大霉素（GM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）亚安培南头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC）2、铜绿假单孢菌/不动杆菌妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢他定（CAZ）左旋氧氟沙星（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E）头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦头孢噻吩（CF）4 、肠球菌氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP）庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL）5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素(CM)肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。
实验三：药敏
纸片扩散法（K-B法）
器材与试剂
菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色 葡萄球菌临床种的6小时肉汤培养物，调整浓 度至0.5麦氏比浊管（相当于1.5×108CFU/ml)； 或挑新鲜培养的单个菌落，在无菌生理盐水中 研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。 培养基：水解酪蛋白培养基（MH琼脂）。 其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。
原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域 扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌 生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定 药物的敏感程度。
方法:（4人一组，2人做金葡菌标准种，2人做 临床种，每种菌选4个不同的药物纸片）
(80单位）
金葡菌
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
结果
细菌生长
-- - -- ++
++
青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照--
结果判断:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度
为该药对检测菌的MIC
影响因素？临床意义？
思考题： 影响因素？ 1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现？ 2、纸片质量 3、接种细菌的菌量 4、孵育的温度和时间 5、操作因素
稀释法
微量稀释法 常量稀释法（试管稀释法）
常量稀释法（试管稀释法）
1、实验目的： 用于测量某种药物对测试菌的最小抑菌浓
度（MIC） 2、实验原理：
将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释， 再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养 后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此 菌的MIC。
K-B纸片法
第二部分
实验方法
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养 基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种丌同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
药敏纸片制备
实验常觃抗菌药物选择： 在标准中分成A、B、C 、U四组, A组所列的抗生素 为常觃首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素, 尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使 用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源丌同时， 如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶 唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多 部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素 过敏、耐受或无反应。
药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些丌常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，丌作为尿道 外分离菌的常觃药敏试验。
药敏纸片制备
以大肠杆菌为例 ①纸片制备 ：选择优质滤纸，用打孔器制成直径 6mm圆形滤纸片。经120℃2h灭菌后备用 ②药物稀释 每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液 需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的丌同浓度配制 药物原液。 药液浓度见下表。 ③课埻的实验中仅使用了青霉素 链霉素 氯霉素
结果判定
第四部分
实验优缺点
K—B纸片法优点
药敏试 验具有重复性较好 、操作简便 、试验成本相 对较低 、结果直观 、容易判读、便于基层开展的优 点。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
KB纸片法 ppt课件
第二部分
实验方法
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养 基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种不同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
药敏纸片制备
A．培养皿烘干法 将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养 皿中，于37℃温箱内保持2~3h即可干燥，或放在无 菌室内过夜干燥。
B．真空抽干法 将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥 器了，用真空抽气机抽干。
药敏纸片制备
纸片的保存 将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中 置冰箱内保存备用。（纸片不应长期保存于常开的普 通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器 中。）收到纸片后应立即保存在-20~4℃中，由于实 验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开 的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前 先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在 室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水 分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完 的放回冰箱中。
结果判定
第四部分
实验优缺点
K—B纸片法优点
药敏试 验具有重复性较好 、操作简便 、试验成本相 对较低 、结果直观 、容易判读、便于基层开展的优 点。
K—B纸片法缺点
K—B纸 片扩散法虽然是一种传统 、经典的药敏试验 方法 ，但随着计算机的发展为细菌检验自动化奠定 了良好基础 ，全自动微生物分析仪的推广和应用K— B纸片扩散法出现药敏试验假耐药 、受人为因素影响 较大、试验耗时长的缺点也渐渐体现出来，同时快速 性 、准确性方面存在不足。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
报告方式
常规报告 敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位达 到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组 织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能 低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在 药物被生理浓集的部位发挥临床效力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组 织或血液内达到的浓度所抑制
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的 菌落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中 （如胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法 生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基 上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
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纸片扩散药敏试验的原理：将含药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
药敏试验根据美国临床标准委员会 (NCCLS) 推荐的 K–B 琼脂法进行。
本实验通过纸片药敏试验法观察多酸化合物对细菌有无抑制作用，为试管二倍稀释法提供有效基础数据。
用无菌棉拭子蘸取已经校正的 0.5 麦氏比浊浓度的菌液，挤掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个 MH 培养基表面，每次将平板旋转 60°，涂抹三次，最后沿周边擦绕两圈，以保证菌液涂抹均匀。
待平板上的水分被琼脂完全吸收后贴含药纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴后不可再拿起。
每个平板贴 5 张纸片，纸片间距不少于 24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm。
在菌接种后 15 min内贴完纸片。
将平板反转，37℃恒温孵育 18~24 h 后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，由平板背面测量最接近的整数毫米数并记录，每个平板各设三个平行组平板，测量抑菌直径时，应取三个平板的平均值为最终结果。
抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
每次药敏试验用大肠杆菌 ATCC25922 和金黄色葡萄球菌 ATCC25923 做质控。
药敏判读标准根据 CLSI 标准 (2009 年) 所载受试药对质控菌的抑菌环直径范围作为实验质控标准（判读标准见表 5-2）[84]。
表5-2 纸片扩散法－用质控菌株抑菌环直径(mm)允许范围监测抗菌药物敏感性试验准确性Table 5-2 Disc diffusion test － according the admissible range of quality-control strain’s inhibition zone diameter to monitor the accuracy of antibiotics susceptibility test (mm)
抗菌药物纸片含药量
（μg）
抑菌环直径(mm)
S I R
大肠埃希菌
ATCC25922
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
KF 30 ≥1815–17 ≤1416–22 27–35 AMP 10 ≥1714–16 ≤1328–35 27–28 CIP 5 ≥2116–20 ≤1530–40 22–30 NOR 5 ≥1713–16 ≤1215–21 29–37
KF: 头孢噻吩；AMP: 氨苄西林；CIP: 环丙沙星；NOR: 诺氟沙星；S: 敏感；I: 中介；R: 耐药。