(推荐)纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析
纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析发表时间：2013-05-21T09:52:49.343Z 来源：《中外健康文摘》2013年第12期供稿作者：刘海珠杨燕徐建利[导读] 接种菌量加大可使抑菌圈减小，反之可使抑菌圈扩大。
刘海珠杨燕徐建利 (山东省威海市立医院264200)【中图分类号】R978.5 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）12-0154-02【关键词】抗菌药物敏感试验方法抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。
在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。
该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。
1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。
纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。
日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。
培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。
使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。
药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。
①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。
②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。
2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
纸片扩散法药敏试验原理
纸片扩散法药敏试验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠纸片扩散法药敏试验原理这档子事儿。
你说这药敏试验就像是一场细菌和药物的大作战！咱得想办法知道哪种药物能把那些捣乱的细菌给收拾得服服帖帖呀。
想象一下，咱把含有药物的小纸片就像一个个小战士一样，整整齐齐地放在涂满了细菌的培养基上。
这些小纸片就开始发挥它们的魔力啦！药物会从纸片里慢慢扩散出来，就像孙悟空画的那个圈圈一样，形成一个药物浓度逐渐变化的区域。
这时候细菌们可就面临考验啦！有的细菌比较弱，一碰到稍微厉害点的药物浓度就不行啦，直接被打败，这周围就变得干干净净，没它们的影儿啦。
可有的细菌比较顽固，还能在药物浓度不那么高的地方顽强抵抗呢。
这不就跟咱生活中一样嘛，遇到困难有的人一下子就被打倒了，有的人还能撑一会儿。
那通过观察这些小纸片周围细菌的生长情况，咱不就清楚哪种药物对这些细菌最有效啦！这多重要啊，就像医生治病得找对药一样，不然那不就白折腾啦！
你看，这纸片扩散法药敏试验不就是这么个道理嘛！它就像是一个神奇的魔法，能帮我们找到制服细菌的法宝。
而且操作起来也不难呀，只要咱细心点，按照步骤来，就能得到准确的结果。
咱可别小瞧了这个试验，它可是为了咱的健康保驾护航呢！医生们能根据这个结果来给病人开药，让病人能快点好起来。
这就像是在黑暗中找到了一盏明灯，给人指明了方向。
所以啊，这纸片扩散法药敏试验原理真的是太实用啦！它就像一个默默无闻的英雄，在背后为我们的健康默默付出呢！大家说是不是呀！。
葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程
葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程1．目的规范葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。
2．适用范围本操作规程适用于葡萄球菌属的细菌。
3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。
3.1现行版本的CLSI M02和M100对葡萄球菌属纸片扩散法药物敏感试验的要求。
3.2本单位处方手册中的抗菌药物名册。
3.3本单位上一年度葡萄球菌属细菌耐药监控数据。
4．质控纸片药敏试验应使用金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSI M100-A19。
5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺。
6．操作步骤根据CLSI M2-A10和M100-S19制定本操作步骤。
6.1菌液制备从孵育了18~24小时的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用无菌生理盐水制成悬液作为接种物，将浊度调整至0.5麦氏标准。
应在接种物制备后15分钟内接种M-H琼脂平板。
用无菌棉拭蘸取菌液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，然后在琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
6.2接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3~5分钟（不要超过15分钟），然后用纸片分配器将纸片放入琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。
各纸片中心相距应大于24mm，通常150mm平板至多放置12个纸片，90~100mm平板至多放置6个纸片。
由于某些药物在纸片放入琼脂平板后几乎立即扩散，所以一旦纸片放入后就不能再移动，若要重新放置，可用一个新的纸片放在平板的另一个位置。
6.3应在纸片贴好后15分钟内将平板倒置放入35℃孵箱，若超过15分钟将使纸片中的抗菌药物提早扩散。
非苛养菌的药敏解释性标准是建立在这些菌株在空气中孵育的基础上，一些药物（如氨基糖苷类、大环内酯类和四环素）的抑菌圈直径受CO2的影响有较大的改变，所以本菌属细菌不能孵育在CO2孵箱。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法常规检测淋球菌药敏试验可靠性探讨
纸片扩散法常规检测淋球菌药敏试验可靠性探讨【摘要】目的：研究分析纸片扩散方法对淋球菌药敏实验检测的有效性和可靠性，以供参考和借鉴。
方法：对2009年9月-2012年9月淋球菌感染患者200例进行本次试验，所有患者均采集淋球菌标本，使用纸片扩散方法和真菌药敏试剂盒，分别检查淋球菌药敏实验结果，对比观察两种方法的检验结果是否存在差异。
结果：使用纸片扩散方法检测，青霉素敏感为5.00%，环丙沙星为14.50%，氟哌酸为7.50%，头孢曲松为87.00%，阿奇霉素为99.00%，壮观霉素为100.00%，使用真菌试剂盒检测，青霉素敏感为5.5%，环丙沙星为13.50%，氟哌酸为8.50%，头孢曲松为85.5%，阿奇霉素为99.50%，壮观霉素为100.00%，两种方法敏感性比较差异无统计学意义（p>0.05）。
结论：使用纸片扩散发对淋球菌药敏实验检测的效果较好，可以用于临床初步检查。
【关键词】纸片扩散法；淋球菌；药敏实验中图分类号 r446.5 文献标识码 b 文章编号 1674-6805（2013）12-0053-02淋病是临床广泛流行的一种性病，其对人类的危害较大。
而流行病学调查统计，我国淋球菌感染比例正呈逐年上升趋势。
随着广谱抗生素的应用，淋球菌耐药菌株也呈逐年增多，导致药物治疗效果不佳，病情反复等[1]，因此，对淋球菌感染患者给予药敏实验可以指导临床用药。
本文研究分析纸片扩散方法对淋球菌药敏实验检测的有效性和可靠性，报告如下。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2009年9月-2012年9月淋球菌感染患者200例作为本次试验的研究对象。
患者均经过临床确诊。
其中男90例，女110例，年龄最大71岁，最小17岁，平均（45.62±7.88）岁。
1.2 方法采集患者的尿道分泌物、宫颈分泌物等，并培养淋球菌。
采集时使用棉拭子在培养基上用划线方法接种，放置于培养箱内，温度为35 ℃，培养24 h后观察结果。
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纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名
纸片扩散法药敏试验
临床意义
得出受试菌株药物敏感性的结论
目录
.1试验原理
.2试验步骤
.3结果分析
.4注意事项
基本信息
中文名
纸片扩散法药敏试验
临床意义
得出受试菌株药物敏感性的结论
试验原理
纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤
1. 待测菌株接种物制备
（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板
（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
3.放置测试药敏纸片
根据测试菌的不同，按照预先设定的分组，将抗菌药物纸片贴于已接种细菌的琼脂表面，每个纸片必须压下以确保与琼脂表面完全接触无论是单独放置的纸片或有纸片分配设备纸片必须分布均匀，两纸片之间圆心的距离不少于24mm，纸片边缘距离琼脂边缘不少于15mm。
我室使用的MH平板直径为90mm，放置不超过5块纸片。
由于一些药物几乎是瞬间扩散的，因此，一旦纸片与琼脂表面接触就不能再移动位置，若位置不佳可在琼脂的另一个位置重新放置一个纸片。
4.孵育
（1）通用情况：在放置好纸片后，15分钟内，将MH琼脂倒置于号孵箱（35℃）中，孵育16～18小时（除外下面列出的需要延长孵育时间的情况）。
嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和链球菌KB纸片法测试平板应放置于含有5% CO2的环境进行孵育。
（2）延长时间培养：①测试苯唑西林、头孢西丁对葡萄球菌的敏感性时，孵育时间必须达到24h，才能满足对结果判断的要求。
②测试万古霉素对金黄色葡萄球菌及肠球菌属的敏感性，孵育时间必须达到24小时。
5.抑菌环直径测量
（1）通用情况：35℃，经过16～18小时的孵育后，将贴有纸片的MH平板置于黑色不反光的背景上，采用游标卡尺，来测量抑菌环的直径（完全抑制区的直径），可以从平板的背面，利用反射光，用肉眼观测，读取最接近的毫米数（读取一个整数）。
没有肉眼可见的明显的生长的部位即是抑菌环的边缘。
一般情况下，在抑菌环边缘出现只能在放大镜下观察到的微小菌落，可以忽略不计。
MH平板上的抑菌环呈均匀的圆形，测试菌株在平板上呈现融合生长菌苔，若出现单个菌落稀疏生长的情况，则说明接种时调制的菌液浓度过稀，需要寻找可能的原因，并重新再一次进行测试。
（2）特殊情况：①苯唑西林对葡萄球菌的抑菌环：抬起平皿，对向光源，利用透射光观察苯唑西林纸片周围的抑菌环中是否有任何细微的菌落生长，若是出现任何可以辨别的生长，均应判定苯唑西林耐药。
②利奈唑胺对葡萄球菌的抑菌环：利用透射光，用游标卡尺读取抑菌环的数值。
③复方新诺明的抑菌环：MH平板中存在一定量叶酸抑制剂的拮抗剂，会导致测试菌轻微的生长，因此，在测量复方新诺明的抑菌环直径时应当忽略细微的生长情况（约20%），而将明显出现生长的地方作为抑菌环的边界进行测量。
结果分析
兼性厌氧菌的抑菌环大小的判读请参照CLSI M100-S27及M45-A3，根据抑菌环的直径的数值报告测试的细菌对测试药物敏感、中介、耐药及SDD（剂量依赖性敏感）。
有些药物只能报告为敏感或不敏感，这是由于没有或极少出现明确的耐药菌株，因而只给出了敏感的折点。
注意事项
药物选择应由临床医师、药师及微生物实验室共同根据CLSI文件进行选择。
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