K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
实验 抗菌药物敏感性试验 PPT课件
（三）结果
• 2.结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 照标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、 耐药（R）报告。 • 3.质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在预期 范围内。如果超出该范围，应视为失控而不 发报告，须及时查找原因，予以纠正。
影响结果的因素
• • • • 培养基 抗菌药物纸片 菌量 操作质量
•
•
药敏纸片的选择
待测菌 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 大肠埃希菌 ATCC25922 药物
AMK、 PEN、OXA、 VAN、GEN 、CIP
AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM AMK、FTX、GEN、PIP、 CIP、IPM
铜绿假单胞菌 ATCC27853
（三）结果
• 1.结果判读： 平板置黑色无反光背景上，测量抑菌环的 直径。 抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长 为限。 有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环； 磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些 都不作为抑菌环的边缘。
步骤和方法
• （一）原理 • （二）方法 • （三）结果
（一）原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接 种检测菌的琼脂平板上。在纸片周围区 域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制， 形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映 检测菌对测定药物的敏感程度，并与该 药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
培养基
• pH：7.2～7.4最适宜，碱性扩大氨基糖 苷类药物的抑菌环，酸性扩大四环素类 药物的抑菌环。 • 琼脂含量：影响抑菌环的大小。 • 厚度：影响抑菌环的大小，以4mm为宜。
抗菌药物纸片
• 纸片含药量：与纸片的重量、吸水性、 直径等有关，影响抑菌环的大小，批量 制备。 • 纸片的保存：须在有干燥剂的容器内低 温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃ 备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取 出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可 打开。
实验四 抗生素敏感实验
（3）大肠杆菌在SS琼脂平板上因分解乳糖，形成红色的、圆形、凸起、 边缘整齐的菌落，多为光滑型菌落。肠道致病菌（沙门菌属、志贺菌属） 在SS琼脂平板上由于不分解乳糖则形成无色透明、中等大小的菌落。 （4）大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上形成红色、中等大小的菌落。肠道致病 菌（沙门菌属、志贺菌属）。在麦康凯琼脂平板上由于不分解乳糖则形成 无色透明、中等大小、光滑型的菌落。
含药纸片
抑菌圈
三、材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌18-24小时琼脂 斜面培养物。 2、培养基：普通琼脂平板 3、分别含各种抗生素（青霉素、链霉素、庆大 霉素、红霉素等）的圆形滤纸片（直径 0.6cm）。小镊子等。
四、方法
1、取琼脂平板两只，每只平板表面分四等份， 于皿底注明待检抗生素名称。 2、于两只平板用棉拭子或接种环分别密涂大肠 杆菌及葡萄球菌于琼脂平板表面中央，注明药名、班 级、姓名、日期等。 4、置于37℃孵育24小时，观察各种药物滤纸 片周围的抑菌环、测量其直径。
五、结果判定
抑菌程度的判定是依照滤纸片周围细菌的 生长与抑菌圈直径大小判定 ①不敏感—纸片周围细菌生长，无抑菌环。 ②轻度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环小 于10mm。 ③中度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环在 10-15mm。 ④高度敏感--纸片周围细菌不生长，抑菌环在 15mm以上。
实验七
抗生素敏感实验
一、实验目的和要求
掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作方
法等、结果判断、意义及质量控制； 了解大肠杆菌、葡萄球菌对几种抗生素的敏 感性。
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼
脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶 解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯 度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长 被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）呈负相关，即抑 菌圈愈大，MIC愈小。
K-B纸片法
第二部分
实验方法
实验方法
培养基制备 药敏纸片制备 细菌制备 接种
培养基制备
培养基的种类： 进行细菌药敏试验所用的培养基种类较多。M—H 培养 基琼脂浓度越大、抑菌圈直径越小。有研究证明3种丌同 M—H 培养基进行纸片扩散法，实验结果相同。 浓度1．0 ～ 2．0 、pH 7．4左右 培养基的质量： 4 mm 厚平板，允许±1mm误差，如此控制平板厚度即 可满足试验要求。有研究证明，平板每增厚或减薄1mm， 抑菌圈相应减小或增大0．7mm。
药敏纸片制备
实验常觃抗菌药物选择： 在标准中分成A、B、C 、U四组, A组所列的抗生素 为常觃首选药敏试验药物,B组为临床使用主要抗生素, 尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使 用：①对A组同类抗生素耐药；②标本来源丌同时， 如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶 唑使用于尿道分离的细菌；③多种微生物感染；④多 部位感染；⑤感染流行的控制；⑤对A组抗生素 过敏、耐受或无反应。
药敏纸片制备
C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或 对A组药物过敏的病人和某些丌常见的细菌 （如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠 球菌）。 U组仅用于尿道中分离的细菌，丌作为尿道 外分离菌的常觃药敏试验。
药敏纸片制备
以大肠杆菌为例 ①纸片制备 ：选择优质滤纸，用打孔器制成直径 6mm圆形滤纸片。经120℃2h灭菌后备用 ②药物稀释 每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液 需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的丌同浓度配制 药物原液。 药液浓度见下表。 ③课埻的实验中仅使用了青霉素 链霉素 氯霉素
结果判定
第四部分
实验优缺点
K—B纸片法优点
药敏试 验具有重复性较好 、操作简便 、试验成本相 对较低 、结果直观 、容易判读、便于基层开展的优 点。
抗菌药物敏感性试验药敏试验
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度
相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
A组 常规和首选药物，其结果应常规报告 B组 首选试验选择性报告。包含一些临床
报告方式
常规报告 敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位达 到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组 织中通常可达到的浓度而治疗反应率可能 低于敏感株。意味着可通过提高剂量或在 药物被生理浓集的部位发挥临床效力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在组 织或血液内达到的浓度所抑制
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的 菌落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中 （如胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法 生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基 上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
kb纸片法药敏实验名词解释
kb纸片法药敏实验名词解释
KB纸片法是一种常见的药敏实验方法，用于测试细菌对抗生素的敏感性。
这项实验通常用于临床医学和微生物学领域。
下面我将从多个角度来解释这些名词。
首先，KB纸片法是指Kirby-Bauer纸片法，是一种半定量的抗生素敏感试验方法。
在这个方法中，细菌培养物被均匀涂布在琼脂平板上，然后在表面放置含有不同抗生素的纸片。
细菌在培养基上生长形成菌落，如果细菌对某种抗生素敏感，它们就不会在靠近含有该抗生素的纸片的区域生长，形成所谓的抑制圈。
通过测量这些抑制圈的直径，可以判断细菌对抗生素的敏感性。
其次，药敏实验是指药物敏感性试验，用于评估细菌或其他微生物对抗生素或其他药物的敏感性。
这项实验对于选择治疗感染性疾病的最佳药物非常重要，因为它可以帮助医生确定哪种药物对特定的病原体最有效。
综上所述，KB纸片法药敏实验是一种通过测量细菌对抗生素的敏感性来评估药物治疗效果的方法，它在临床医学和微生物学领域有着广泛的应用。
希望这些解释能够帮助你更好地理解这些名词。
K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析
２ ． 治疗 阴道炎 ．５ ２
陈 晓飞等 ” 取新 鲜车 前草 煎 汁 ，对 ４ 例 阴道 炎 患者 进行 浸 泡治 ８
疗 ，结果 ２例外阴湿疹患者 全部痊愈 ，１ ９ ３ 例非特异性 阴道炎及６ 老年 例 性 阴道炎 患者 ，治疗后症状 明显 减轻。 ２． ．６治疗 急性乳腺炎 ２ 急性乳腺 炎为初产妇 的常见 病 ，分 为未 化脓 型和化脓 型两种 。陈 福 仁等 将 捣烂 的车 前草 捏 成鼻 孔 大小 的 圆锥 状 ，塞 入患 者 鼻 腔 ， １ｂ次 ，最多经 ３ ５／ ． 次治疗 后 ，３ 例未化 脓型者均可痊 愈 ，但该法对 化 １ 脓性 乳腺炎 无 效。王 寿 昌等 在 ｌ 年 期 间对 ２ 例 患者 使用拍 打 尺 Ｏ １
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【２ １】陈剑 屏 ， 霞 ． 前草 汤 治疗 慢性 活 动肝 炎 ２２ ［ ． 海 中医 袁启 车 ３ 例 Ｊ上 】
药杂 志 ， ０ ，１ ８１． ２ ２１： －９ ０ １
［３ １】青俐 ． 车前草穴位 贴敷 治疗产后尿潴 留叨． 中医２０， （ ： － ． 四川 ０１９６２ ２ １ ）２ ２
［４ １］金顺 英 ， 家 ， 世英 ， ． 前草 治疗 单 纯血 尿 ［ ． 张兴 张 等车 Ｊ 长春 中医 学 ］
院学 报，９ ７ｌ （） ６ １９ ， ６： ． ３ １
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抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
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平板霉素类似物生物活性评价
平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：
1.原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂
仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台
试剂：样品溶液、培养基
3.菌液的配置
从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板
在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝
固。
5.粘贴药敏纸片
用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
分别吸取样品溶液5μL点在滤纸片上，点样后放置30min，待其扩散均匀相对干燥后，倒置于37℃培养箱中恒温培养16-20h。
培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用。
6.结果判定
培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。
抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，有些抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。
按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。