纸片扩散法
纸片琼脂扩散实验报告
一、实验目的1. 了解纸片琼脂扩散法的原理和操作步骤。
2. 掌握纸片琼脂扩散法的应用，评估细菌对不同抗菌药物的敏感性。
3. 分析实验结果，为临床用药提供依据。
二、实验原理纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer法）是一种常用的细菌药敏试验方法。
其原理是将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，药物在琼脂中扩散，形成递减的浓度梯度。
当纸片周围的药物浓度低于细菌的最小抑菌浓度（MIC）时，细菌生长被抑制，形成无菌生长的透明圈，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物浓度和细菌敏感性呈负相关。
三、实验材料1. 细菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。
2. 抗菌药物纸片：青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素等。
3. 琼脂培养基：水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton琼脂，MH琼脂）。
4. 无菌器械：接种环、镊子、酒精棉球等。
5. 环形量器、纸片分配器、计时器等。
四、实验步骤1. 准备工作：将MH琼脂培养基熔化，待冷却至约45℃时，倒入平板中，待凝固。
2. 接种：用接种环挑取适量细菌菌种，涂布于平板表面，均匀分布。
3. 贴药片：用纸片分配器或镊子将抗菌药物纸片贴于平板表面，纸片中心距离平板边缘不小于15mm，纸片间距不小于24mm。
4. 观察与记录：将平板放入37℃恒温箱中培养18-24小时，观察并记录抑菌圈的大小。
5. 结果分析：根据抑菌圈的大小，查阅药物敏感谱，判断细菌对不同抗菌药物的敏感性。
五、实验结果与分析1. 金黄色葡萄球菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为敏感，抑菌圈直径分别为15mm、10mm、20mm；对庆大霉素表现为耐药，无抑菌圈形成。
2. 大肠杆菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为18mm。
3. 肺炎克雷伯菌：对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟均表现为耐药，无抑菌圈形成；对庆大霉素表现为敏感，抑菌圈直径为16mm。
根据实验结果，金黄色葡萄球菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟敏感，对庆大霉素耐药；大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感；肺炎克雷伯菌对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟耐药，对庆大霉素敏感。
kb纸片琼脂扩散法原理
kb纸片琼脂扩散法原理KB纸片琼脂扩散法是一种常用的分子生物学技术，可以用于分析DNA、RNA、蛋白质等分子的浓度、大小、电荷等性质，为分子生物学研究提供了重要的实验手段。
下面我们来详细介绍一下KB纸片琼脂扩散法的原理和操作步骤。
一、原理KB纸片琼脂扩散法是利用琼脂凝胶的孔隙和分子的迁移速度不同来实现分子的分离和分析。
琼脂凝胶是一种由海藻提取的多糖物质，可以在水中形成均匀的凝胶状物质，并具有透明度和可扩散性。
当样品在凝胶上扩散时，由于分子大小和电荷的差异，不同的分子会在凝胶孔隙中扩散的速度不同，从而形成不同的“扩散环”，用来分析样品中不同分子的含量和性质。
二、操作步骤1、制备琼脂凝胶：将琼脂粉溶解在热水中，加入缓冲液和硼酸，调节pH值和含量，混合均匀后倒入琼脂扩散皿中，待其凝固后即可作为样品分析的凝胶。
2、制备样品：将待测样品加入适当的缓冲液中，加热（蛋白质样品需加入还原剂），再冷却至室温，使其处于最适合扩散的状态。
3、将样品加到凝胶中央的凹槽中，尽量避免产生气泡，使其均匀地扩散到凝胶中。
4、放置凝胶经过一定时间，待不同分子扩散到一定范围时，用无色显微镜观察凝胶表面出现的“扩散环”数量和大小。
5、根据“扩散环”的数量和直径，利用数学公式和标准曲线，计算出样品中分子的浓度、电荷等性质。
6、可将凝胶切下来进一步分析或保存，同时清洗皿子和工具以备下次使用。
三、注意事项1、制备凝胶要注意温度、pH值的控制，否则会影响凝胶的质量和效果。
2、将样品加入凝胶要均匀、避免气泡，避免扰乱分子扩散的状态。
3、观察“扩散环”要避免光源过强或过弱，过弱会使“扩散环”难以看清，过强会使皿子发热、影响凝胶扩散。
4、注意安全操作，避免接触凝胶时损伤皮肤和口腔。
总之，KB纸片琼脂扩散法是一种简单、快捷、便宜的分子生物学技术，可为不同领域的科学研究提供重要的帮助，但我们需要认真学习和掌握正确的操作方法和注意事项，才能充分发挥其作用。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
纸片扩散法实验报告
1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。
2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。
二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。
在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。
2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。
3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。
四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。
2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。
3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。
直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。
4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。
5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。
1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。
2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。
3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
纸片扩散法资料
抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。
材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。
2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。
每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。
流感嗜血杆菌纸片扩散法 clsi标准
流感嗜血杆菌纸片扩散法 clsi标准流感嗜血杆菌(Streptococcus pneumoniae)是一种常见的细菌，可以引起各种疾病，包括肺炎、中耳炎和鼻窦炎等。
准确和迅速地检测流感嗜血杆菌对于发现感染病例、进行治疗和控制疾病的传播起着至关重要的作用。
在这方面，流感嗜血杆菌纸片扩散法(DiskDiffusion Test)是一个常用的检测方法，被广泛采用并符合CLSI标准。
CLSI标准(Clinical and Laboratory Standards Institute)是一个全球性的非盈利性组织，致力于提供各种临床和实验室标准，用于指导和规范医学实验室的操作。
流感嗜血杆菌纸片扩散法是根据CLSI标准制定的一种敏感性试验方法，可用于评估细菌对抗生素的感受性。
流感嗜血杆菌纸片扩散法的基本原理是将含有不同抗生素的纸片，放置在与感染样本培养物接触的富含营养物的琼脂培养基上。
细菌会从感染样本中扩散到周围的琼脂培养基上，并与纸片上的抗生素相互作用。
如果细菌对某种特定抗生素敏感，它们在与该抗生素接触时会表现出抑制生长的效果。
这种抑制生长的效果可以通过观察琼脂培养基上的细菌生长抑制区域来判断。
在进行流感嗜血杆菌纸片扩散法之前，需要先培养出细菌样本。
通常，将含有细菌的标本涂布在琼脂培养基上，然后在适当的条件下孵育。
当细菌在琼脂培养基上生长后，将抗生素纸片按照CLSI标准上的推荐规程放置在琼脂培养基上，通常是在琼脂平板上均匀分布4-6个纸片。
接下来，将培养基和纸片一同孵育，以便细菌能够与纸片上的抗生素相互作用。
经过适当的时间孵育后，通过观察琼脂平板上的生长抑制区域，可以评估细菌对各种抗生素的感受性。
流感嗜血杆菌纸片扩散法有许多优点。
首先，它是一种简单、快速和经济的检测方法，适合用于一般的临床实验室。
其次，它可以同时测试不同抗生素对细菌的效果，可以为临床医生提供有关合适的治疗方案的指导。
此外，这种方法的结果也很容易解读和比较。
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四、实验内容与步骤
（二）药物敏感试验（纸片琼脂扩散法） ① 取100-200μl菌液均匀涂布平板； ②用无菌镊子将纸片贴于含菌琼脂表面，每面贴
3~4个纸片，放置15分钟。为了使药敏片与培养基紧密 相贴，可用镊子轻按几下药敏片。
③倒置在28℃培养箱中培养24h观察结果。 ④用尺量包括纸片直径在内的抑菌环最大直径，判 定结果（敏感、中度敏感、耐药）。
一、实验目的
1、掌握细菌纯化再培养的方法 2、掌握人工药敏实验方法
1
二、药敏试验常用方法
1. 纸片扩散法（Disk Diffusion Test）： Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法）
和直接纸片药敏法 2. 稀释法（Dilution Test）：
包括琼脂稀释法（药物混合在培养基中） 和肉汤稀释法（抗生素梯度稀释） 3. 抗生素浓度梯度法-E 试 验（E-test）
7Leabharlann 药物敏感实验判定标准抑菌圈直径（毫米）
敏感度
20以上
极敏
15-20
高敏
10-14
中敏
10以下
低敏
0
不敏
* 具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸 片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。
四、思考题
1、药敏试验常用方法有哪几种？ 2、影响药敏结果的因素有哪些？
10
2
二、实验原理
将含有一定量抗菌药物的纸片或药片， 平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸 片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏 感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制， 而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断 细菌对抗菌药物的敏感性。
3
影响药敏结果的因素
一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注 平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，且培养基 内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子。 二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈 变小。 三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的 结果，需精确配制。 四、培养时间：一般在37℃下培养18-24小时。
三、实验材料与器材
1、实验材料 分离培养的细菌、平板，药敏纸片
2、实验器材 超净工作台、分光光度计、量尺或游标卡尺
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四、实验内容与步骤
（一）倒平板：固体培养基的准备 （二）细菌纯培养及菌悬液的制备
确定细菌的浓度：将细菌离心沉淀后用无菌PBS 稀释至OD值为0.2左右（细菌OD600吸光度在0.2-1.5 范围内，细菌数与OD值呈线性相关，OD值为0.2的 细菌数约为1*108 CFU/mL）。