纸片扩散法药敏试验室内失控结果纠偏探析
纸片扩散法药敏试验质量控制条件及质控菌株
不满意结果的处理程序（若干） 环境检测及维持程序（控制限） 计量校准程序
细菌检验质量文件的种类
结果审核程序及报告程序
患者隐私保护程序
危急值报告程序
临床意见征询制度及程序 临床意见处理处理程序 患者抱怨处理程序
细菌检验质量文件的种类
细菌学检验质量管理 相关文件
必要性何在？
避免“传说”导致的知识老化 避免检验行为的随意性、盲目性 有利于重现（保证稳定的质量）
有利于遵循科学、合理的流程
有利于工作的连续性
有利于明确责任（告知）
有利于举证 有利于可持续发展
有关SOP
建立文件 文件格式要规范
文件内容与实际工作要符合，具可操作性
触酶试验
每次操作均应进行IQC
阳性质控菌株可选择“金黄色葡萄球菌”
阳性结果为“产生气泡”
阴性质控菌株可选择“化脓性链球菌”
阴性结果为“无变化”
细菌鉴定试验的质量控制
吲哚试验
每批号至少做一次（确保储存条件和有效期）
阳性质控菌株可选择“大肠埃希菌”
阳性结果为“培养基产生红色”
阴性质控菌株可选择“阴沟肠杆菌”
培养基：Mueller-Hinton 琼脂 接种液：生长法或直接菌落悬液 孵育：35℃；空气；16-18h，如测试 苯唑西林、甲氧西林和奈夫西林时， 孵育时间需要增至 24h
建议
SOP 参照物 标准 业务（点+面）
执行
监督自查
药敏试验结果的正确解读
万古霉素 利 ≤0.5 S μg/m
奈唑胺 替加 ≥8 R
环素
≥≤80.125 RS
≥512 R
2
S
l μg/m l μg/m
万古霉素S折 ≤4 点 利奈唑胺S折 ≤4 点
大肠埃希菌 阿米卡星 庆大霉素 环丙沙星 左氧氟沙星 复方磺胺 头孢曲松 氨曲南 头孢他啶 头孢吡肟 哌拉西林/他唑巴坦
厄他培南 亚胺培南 ESBL筛选
R
I
S
自动化仪器－微量稀释法，抗菌药
头孢他 啶
≤1 187 20
≥2 1
物不能任意选择
4
稀释法：检测最低抑菌浓度 （MIC）
S
I
R
头孢他啶 ≤4 8
≥1
6
GN13
阴 性 菌 药 敏 卡
抗菌药物 氨苄西林 氨苄西林/舒巴坦 哌拉西林/他唑巴坦 头孢唑啉 头孢曲松 头孢他啶 头孢吡肟
CLSI折点
≤
≥
肠球菌属
粪肠球菌 葡萄球菌 属、淋病 奈瑟菌 肠球菌
肠杆菌科
所有菌属 所有菌属 肠杆菌科
可被推测的抗菌药物药敏结果
所有β内酰胺类及与酶抑制剂复合药耐药
对多西环素、米诺环素敏感 罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、地红霉素敏感 和耐药 不产β内酰胺酶的肠球菌对阿莫西林、哌拉西林 及其与酶抑制剂的复合剂敏感和耐药 亚胺培南敏感 所有β内酰胺类及与酶抑制剂复合药敏感
1
64
4
64
1
64
1
16
0.5
8
0.25
4
0.25
8
2
64
1
16
1
16
16
512
1
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
纸片扩散法实验报告
1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。
2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。
二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。
在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。
2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。
3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。
四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。
2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。
3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。
直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。
4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。
5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。
1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。
2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。
3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。
纸片法药敏试验失败的原因分析及解决措施
纸片法药敏试验失败的原因分析及解决措施作者：王林果康娟来源：《兽医导刊》 2015年第4期王林果康娟/ 普莱柯生物工程股份有限公司兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。
扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。
稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数兽医临床实验室和基层单位所采用。
扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前兽医临床应用较多的方法是纸片法，以下针对该法进行分析。
一、问题的提出按照标准操作程序进行操作，测量出抑菌圈大小，根据药敏实验标准进行判读，获得比较敏感的药物，现场使用常常出现敏感药物得不到良好的治疗效果，或者药敏实验不敏感的药物在现场使用却能获得较好的治疗效果，这是很多从事兽医实验室工作的兽医想不明白的，是不是药敏试验做错了？还是药物是假药？又或者是药敏试验本身就不靠谱？一堆的问号让兽医工作者无所适从，那么究竟为何会有这样的结果，有了这样的结果如何改善？二、问题分析1. 药敏实验步骤（纸片法）。
（1）无菌采集合适的病料组织，无菌接种培养皿或者肉汤进行再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h 增菌。
（2）在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。
（3）用无菌镊子将纸片（提前制备好）放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。
为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。
一般各纸片中心相距应大于24 mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5 ～ 6片。
（4）标记每种药敏纸片的名称。
（5）贴完纸片的平皿15 min 后再置于37℃温箱中培养16 ～ 24 h，观察记录结果。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。
中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。
药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。
试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。
2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。
纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制
中国卫生产业在临床感染性疾病、菌种的耐药性、抗生素的合理应用等。
抗菌药物敏感试验是实验室不可缺少的,常用方法有Etest 法、稀释法、Kirby-Bauer 法以下简称(K-B 纸片扩散法)以及全自动微生物分析仪等。
纸片扩散法是WHO 推进使用的微生物敏感性测定方法[1],能在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制,形成透明的抑菌圈。
根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[2]。
其特点是操作简单,测定的药物可随临床需要而调整,易检测个别特殊耐药菌株[3],更重要是扩散法有一套完整的质量控制,结果可靠,是微生物常用方法,全自动或半自动仪器分析法是一种微量肉汤稀释法[4]。
该文将平时工作中的质量控制要点阐述如下。
1纸片扩散法误差原因一次质量控制结果错误,常被认为是一种统计上的随机变化。
①接种平皿不均匀;②抑菌环量取记录直径有误;量取工具有误差;③标准菌株保存、污染、过期等改变;④细菌接种量,在K-B 纸片扩散法药敏实验菌液量规范中提出固定接种0.35mL 菌液量[5];⑤0.5管麦氏浊度管未摇匀、已过期;⑥孵育温度、时间、放置、气体等不合格;⑦MH 培养基制作、深度、厚度、购入批次批号等有关;⑧药敏纸片质量改变。
立即观察药物平板,重复试验一般能够解决,如仍失控必须恢复每日质控查找原因。
⑨菌液浓度未得到控制;未混匀;⑩发现问题及时查找原因进行校正。
2质控测定次数MH 琼脂和药敏纸片更换批次批号必须用质控菌株进行测试。
检测标本时应与质控菌株一起检测可监控整个操作过程。
当与常规标本一起连续测定质控菌株30d 或每种药物与相应的每种细菌的30个抑菌环直径少于3个结果超出常用抗菌药物纸片对质控菌株的抑菌环直经允许范围时。
达到以上要求可每周1次检测。
发现有一个不符合的结果立即查找原因。
发现质控菌株错误、含药纸片种类错误或标准菌株被污染等及时纠正,如果不能发现原因立即改为每日检测。
3抑菌环的质控常用抗菌药物纸片对质控菌株的测定抑菌环直径应控制在的允许范围内。
纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制
纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制作者：钟伟萍来源：《中国卫生产业》2017年第26期[摘要] 目的抗菌药物敏感试验是临床抗菌治疗的指导性实验。
关系到抗菌药物治疗成败。
方法多种方法中选WHO推荐使用的利于基层医院开展的纸片扩散法。
结果日常常规操作中应控制好平板厚度、琼脂浓度、细菌接种量、琼脂种类及多种因素。
结论在严把纸片扩散法抗菌药物敏感实验的操作过程的同时，有必要做好质量控制，确保结果准确性，服务于临床。
[关键词] 纸片扩散法；抗菌药物敏感试验；质量控制[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）09（b）-0038-02Quality Control of Anti-bacterial Drug Sensitive Test of Paper Diffusion MethodZHONG Wei-pingWeihai Municipal Second Hospital Affiliated to Qingdao University， Weihai， Shandong Province，264200 China[Abstract] Objective The sensitive test of antimicrobial agents is the guiding experiment of clinical antibacterial therapy， which is related to the success or failure of antibacterial drug treatment. Methods The paper diffusion method of the primary hospital is recommended by the WHO among the various methods. Results The plate thickness， AGAR concentration， bacterial inoculation，AGAR variety and various factors should be controlled in routine operation. Conclusion In strict control of the paper diffusion method of antimicrobial susceptibility testing process， it is necessaryto grasp the quality control to ensure the accuracy of the results， so as to serve the clinical practice.[Key words] Paper diffusion method； Sensitive test of antimicrobial agents； Quality control在臨床感染性疾病、菌种的耐药性、抗生素的合理应用等。
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纸片扩散法药敏试验室内失控结果纠偏探析
【关键词】纸片扩散法；药敏试验；失控结果纠偏
临床微生物药物敏感试验包括纸片扩散法、稀释法、e试验法和自动化仪器法，由于纸片扩散法操作简单、价格低廉，是普通微生物实验室的常规药敏方法。
药敏试验的质控是通过对质控菌的药物敏感性检测作为主要的质量保证程序来确保整个药敏过程的准确性。
根据临床实验室全面质量管理的要求，为保证微生物检验报告的可靠性，提高药敏试验对临床用药的指导作用，必须进行室内质量控制，同时对室内质控结果还应进行规范化分析，以提高室内质控水平，充分保证质量控制达到预期的效果。
1 结果与分析
1.1 严格按照检验操作规程[1]的要求，采用临床检验中心提供的大肠埃希菌atcc25922，药敏纸片有氧氟沙星、阿米卡星、头孢他啶、氨曲南、氨苄西林等，与常规标本一起测定质控菌株以鉴定整个操作过程，连续测定30d，每种药物的抑菌环直径只有少于3个结果超出范围，达到以上要求可执行每周一次检测，如发现一个不符合的结果，应立即寻找原因，如果发现诸如质控菌珠错误、含药纸片种类错误或标准菌珠被污染等明显错误，加以纠正后重新测定，找到原因后连续做5d质控，若5d数据均在质控范围，说明原因已找到，可改为每周质控，若连续5d数据中出现一个数据失控说明尚未找到真正失控的原因，应继续查找。
在恢复每周质控前仍应有连续30d质控数据支持。
如果不能发现原因，须立即改为每日
检测，直至问题解决。
1.2 根据上述方法要求对大肠埃希菌atcc25922连续3个月的药敏试验结果进行分析（2011.7、8、9），发现2011.9月份（见附表），阿米卡星抑菌圈波动较大，超出质控范围，立即从培养基的质量、纸片的效期、冰箱和孵箱的温度、0.5号麦氏比浊管等方面入手排查原因。
最后用表面电极法检测mh琼脂的ph值，发现ph〈7.2是阿米卡星抑菌圈缩小的原因针对上述原因重新按要求制作了mh平板，并严格校对ph7.2-7.4之间，连续30d试验，结果均在控。
2 讨论与改进
2.1 临床微生物实验室质量控制是保证实验室质量的一个重要
措施[2]，同样包括分析前、分析中和分析后质量控制。
分析前质量控制包括病人的准备，采集时间应在发病早期，应用抗生素前或下次用药前（血药浓度相对较低）；盛装细菌培养的标本必须使用密封、灭菌的容器，但不得使用消毒剂消毒灭菌；标本留取后应尽快送检，有些标本如淋球菌、肺炎链球菌、嗜血杆菌还需要保温送检等等。
标本送达后实验室应严格核对发现不合格的标本应注明理由退回。
2.2 分析中质量控制是全面质量管理的重要组成部分，除了要加强人员培训和组织管理外，还应加强设备、试剂、培养基以及菌珠的标准化管理。
①每天应对孵箱、冰箱进行温度检查并做好记录，发生偏差及时采取纠正措施，其他如显微镜应保证清洁干澡无污染；②培养基应使用合格的mh琼脂，其平板厚度应一致为4mm，无
菌试验合格，2-8℃下可使用7d，使用前将平板放35℃孵育30min 去除平板表面多余的水分，保存过久或脱水严重的平板不应使用，要严格控制其ph为7.2-7.4，贴药敏纸片时应保证各纸片的中心距不少于24mm，与平板边缘的距离不少于15mm；③常规用于菌悬液的浓度为1.5*10e8cfu/ml，相当于0.5号麦氏浊度标准管，保质期6个月，使用前应充分混匀；④含药纸片药量高低是影响抑菌环大小的重要因素，在制备时应保证纸片的含药量一致并冷冻保存，保存过程中应保持干燥，使用前应平衡1-2h，防止纸片表面产生冷凝水，用毕应及时冷藏或冷冻保存，不得使用过期的纸片；⑤配制好的菌悬液应在15min内接种至mh平板，接种好的平板应在室温平放3-5min吸去多余的水份，然后再将纸片贴到平板上，贴好纸片的平板应在15min内翻转，置35℃孵箱中18-24h，平板最多2只叠放在一起以保证平板受热均匀，结果测量时应使用带表卡尺或精确度1/10mm的量具。
2.3 分析后质量控制包括鉴定与药敏结果的报告、解释、复核以及结果报告后的临床反馈，复核主要体现在菌种的复核以及药敏结果与菌种的吻合上，最后通过临床信息反馈可以验证检验结果的可靠性，以此进一步改进实验室的工作质量，密切联系临床，更好地为临床提供诊断治疗的参考价值。
总而言之，作为检验人员应时刻牢记质量是检验科工作的最终目标，做好微生物室内质控是微生物标本鉴定和药敏报告的质量保证。
所以我们有责任和义务认真做好室内质控，保证室内质控的所
有环节规范、有序、在控，进一步提高检验结果的准确性，为临床提供更有价值的信息。
参考文献
[1] 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[m].第三版.南京：东南大学出版社，2006：896.
[2] 孔海深，陈瑜.临床微生物检验的质量控制.检验医学高级教程，2010，6（1）：1012-1017.。