纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验
纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
纸片扩散法药敏试验
纸片扩散法药敏试验一、原理纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、进行药敏实验指征为保证治疗效果，对引起感染的任何病原菌，若不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进行药敏试验。
尤其当病原菌属于对常用抗菌药物能产生耐药时，就更需进行药敏试验。
若感染是公认的对某一高效抗菌药物敏感的微生物引起的，就很少需要进行药敏试验了。
三、标本要求参加药敏试验的菌株包括从临床标本中分离的常见的、快生长的菌株，如肠杆菌科菌、葡萄球菌、肠球菌、非发酵糖菌；还包括某些苛养的病原菌，如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及其他链球菌、淋病奈瑟菌等。
标本内的正常菌群，通常不作药敏。
对每一种可能致病的细菌进行敏感试验时，使用的单个菌落都应选自原始的琼脂平板，鉴定种属的过程常与此同时进行。
不同菌种的混合物不能在同一药敏平皿上进行试验。
除非在临床急症患者的标本（如阳性血培养物）经涂片革兰染色提示单一的病原菌，一般应避免直接用临床标本（如无菌体液和尿液）做药敏试验。
若用临床标本作了直接药敏试验，也必须按标准方法重复第二次药敏。
四、选药原则详见临床实验室标准化研究所（CLSI）对各种非苛养菌和苛养菌进行常规药敏试验和报告时的选药指南表。
表中的抗菌药物可满足绝大多数临床实验室的常规需要，在此表中各种抗菌药物针对具体的菌种或菌群被分成许多纵列，每一列又根据不同的选择要求分成A、B、C、U等不同的组，其中A组药物用于常规和首选试验，其结果也应常规报告。
微生物实验 药物敏感实验
微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。
⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。
⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。
⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。
涂布均匀。
⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。
五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。
纸片扩散法药敏试验(KB法)
纸片扩散法药敏试验(KB法)纸片扩散法药敏试验，又称为KB法，是一种广泛应用于临床微生物实验室的抗生素敏感性检测方法。
通过该方法，可以快速、准确地评估病原菌对抗生素的敏感性，为临床医生提供治疗选择的依据。
纸片扩散法药敏试验的基本原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有病原菌的培养基上，抗生素在培养基中扩散形成浓度梯度，抑制病原菌的生长。
通过测量纸片周围形成的抑菌圈直径，可以判断病原菌对抗生素的敏感性。
抑菌圈直径越大，表示病原菌对该抗生素越敏感。
纸片扩散法药敏试验具有操作简便、成本低廉、结果易于判读等优点，是目前临床上使用最广泛的药敏试验方法之一。
然而，该方法也存在一定的局限性，如受环境因素影响较大，结果受操作人员技术熟练程度影响等。
1. 选择合适的培养基：纸片扩散法药敏试验需要使用含有适量营养物质的培养基，以保证病原菌的生长。
2. 控制接种量：接种量过多或过少都会影响试验结果，因此需要严格控制接种量。
3. 选择合适的抗生素纸片：根据病原菌的种类和临床需求，选择合适的抗生素纸片进行试验。
4. 观察抑菌圈：在规定时间内观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径，判断病原菌对抗生素的敏感性。
5. 结果报告：根据抑菌圈直径，按照相应的标准判断病原菌对抗生素的敏感性，并将结果报告给临床医生。
纸片扩散法药敏试验(KB法)是一种简单、实用的抗生素敏感性检测方法，在临床微生物实验室中具有广泛的应用。
通过规范操作，可以提高试验结果的准确性，为临床治疗提供有力支持。
纸片扩散法药敏试验(KB法)的进一步探讨我们需要了解KB法的基本操作步骤。
将含有特定抗生素的纸片贴在已经接种了细菌的琼脂平板上。
随着时间的推移，抗生素会从纸片中扩散到琼脂中，形成抗生素浓度梯度。
如果细菌对该抗生素敏感，那么在纸片周围就会形成一个无细菌生长的区域，即抑菌圈。
抑菌圈的大小与抗生素的浓度和细菌的敏感性有关。
KB法的准确性受到多种因素的影响。
纸片的抗生素含量必须准确，以保证试验的重复性。
实验6：纸片扩散法测定微生物的药敏性
实验6 抗生素等对细菌的药敏性检测antimicrobial susceptibility testing in vitro（圆盘滤纸片法disc diffusion test）一、实验目的：1、了解抗生素及化学试剂对微生物生长的影响2、掌握不同化学试剂的作用原理、常用浓度及使用方法二、实验原理许多微生物可以产生抗生素，能选择性的抑制或杀死其他微生物。
凡是抗菌谱即抗菌范围不广泛的抗生素称为窄谱抗生素，如青霉素只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对革兰氏阴性菌、结核菌、立克次体等均无疗效，故青霉素就属于窄谱抗生素。
原来窄谱的抗生素如青霉素经过改造，产生了许多半合成的青霉素，扩大了原来的抗菌范围，如氨苄青霉素，不但对革兰氏阳性菌有效，而且对革兰氏阴性菌也很有效，对伤寒杆菌、痢疾杆菌效果也不错。
不同化学药品或同一化学药品对不同微生物的杀菌能力不同，此外，试剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。
应用前需进行试验，灵活选择。
三、实验器材1、菌种：培养24~28 h大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种。
2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液3、仪器与其他用品：无菌平皿，无菌吸管（1ml），酒精灯，接种环，涂布棒，无菌滤纸片，无菌镊子，记号笔, 消毒棉球和培养箱。
四、实验步骤（以金黄色葡萄球菌操作为例）（1）菌液制备：将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
（2）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。
（平板厚度均匀，滤纸片大小一致）（3）涂平板：无菌操作，用无菌棉棒儿蘸取菌液（金葡）。
将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验
平板霉素类似物生物活性评价平板霉素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VREF)等耐药菌具有很好的抑制活性。
抗菌活性的测试主要针对MRSA和VREF进行测定和相比。
最小抑制浓度（MIC）被确定抑制细菌生长的最低浓度。
通过生物活性数据的反馈，进一步指导平板霉素类似物的合成方向，希望获得活性更高、药效活性更好的抗耐药菌抗生素和药物先导化合物。
纸片扩散法测定抗生素敏感试验及MIC：1.原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
2.仪器及试剂仪器：纸片、试管、移液枪、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、pH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器、超净工作台试剂：样品溶液、培养基3.菌液的配置从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mL LB肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108CFU/mL。
4.接种平板在超净工作台中，用量筒量取15mL配置好的灭菌培养基，倒在平板中，冷却凝固。
吸取稀释好的菌液500μL于洁净的灭菌试管中，加入4500μL的培养基，冷却到不烫手，摇匀，均匀倾倒置已凝固的平板表面，放置冷却至凝固。
5.粘贴药敏纸片用纸片分配器或无菌镊子取纸片（直径6mm，厚度1mm），贴于平板表面，并用镊子尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm。
纸片扩散法资料
抗生素敏感实验——纸片扩散原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。
在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。
不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小原理通俗说法：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。
材料（以大肠杆菌为例）：1.药品及细菌——诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。
2.器材——纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器方法1.培养基的制备：2.药敏纸片的制备2.1纸片制备：选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。
每200张一管，经120℃2h灭菌后备用2.2药物稀释每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。
纸片扩散法药敏试验原理
纸片扩散法药敏试验原理
嘿，朋友们！今天咱来唠唠纸片扩散法药敏试验原理这档子事儿。
你说这药敏试验就像是一场细菌和药物的大作战！咱得想办法知道哪种药物能把那些捣乱的细菌给收拾得服服帖帖呀。
想象一下，咱把含有药物的小纸片就像一个个小战士一样，整整齐齐地放在涂满了细菌的培养基上。
这些小纸片就开始发挥它们的魔力啦！药物会从纸片里慢慢扩散出来，就像孙悟空画的那个圈圈一样，形成一个药物浓度逐渐变化的区域。
这时候细菌们可就面临考验啦！有的细菌比较弱，一碰到稍微厉害点的药物浓度就不行啦，直接被打败，这周围就变得干干净净，没它们的影儿啦。
可有的细菌比较顽固，还能在药物浓度不那么高的地方顽强抵抗呢。
这不就跟咱生活中一样嘛，遇到困难有的人一下子就被打倒了，有的人还能撑一会儿。
那通过观察这些小纸片周围细菌的生长情况，咱不就清楚哪种药物对这些细菌最有效啦！这多重要啊，就像医生治病得找对药一样，不然那不就白折腾啦！
你看，这纸片扩散法药敏试验不就是这么个道理嘛！它就像是一个神奇的魔法，能帮我们找到制服细菌的法宝。
而且操作起来也不难呀，只要咱细心点，按照步骤来，就能得到准确的结果。
咱可别小瞧了这个试验，它可是为了咱的健康保驾护航呢！医生们能根据这个结果来给病人开药，让病人能快点好起来。
这就像是在黑暗中找到了一盏明灯，给人指明了方向。
所以啊，这纸片扩散法药敏试验原理真的是太实用啦！它就像一个默默无闻的英雄，在背后为我们的健康默默付出呢！大家说是不是呀！。
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纸片扩散法药物敏感试验若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。
而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。
WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。
本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。
无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。
但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分离提纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
试验方法：一、试验材料：(一)培养基：Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。
多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基；维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。
此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批次间差异等方面均优于其他培养基。
若检测肺炎链球菌的敏感性时，须在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。
测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和 2.5mg/ml 辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。
在水平的实验台上倾制。
琼脂厚为4mm，允许误差为土1mm。
琼脂凝固后，应测一下pH。
琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
若当天不用，用塑料袋密封包装贮藏于冰箱（2-8℃）。
每批平板都应抽样，在30-50℃下培养24h或更长时间检查是否被感染。
MH琼脂培养基配方(1L)：Beef Extract 2.0g Acid Hydrolysis of Casein 17.5gStarch 1.5g Agar 17.0gFinal PH 7.3 at 25℃高压灭菌后立即水浴冷却至45-50℃。
(二)药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。
采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。
药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。
用以下两个指标判定纸片的质量：1、片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。
测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。
35C过夜培养后，记录6个抑菌环直径，其最大和最小之差应小于1～2mm。
2、准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。
纸片的合理保存十分重要。
药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。
只拿出少量放4℃备日常工作用。
装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。
如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，容易潮解。
(三)质控菌株K—B法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。
测定MH琼脂是否适合做磺胺类试验，须用粪链球菌ATCC 29212或33186。
上述质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。
实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。
常规质量控制菌株应每月更换1次。
质控菌株简便保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M-H 平板复活。
然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。
每月取1支，传种细菌供常规使用。
待用剩至最后1支，再传代在M-H 平板上，接种一批高层琼脂管备用。
如此连续可避免原始菌种不接触抗生素，以防变异。
(四)菌液比浊管为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。
采用比浊的办法控制菌悬液浓度。
接种菌液浓度为 1.5×l08／m1，浊度相当于麦氏标准比浊管第1号管的1／2。
比浊管配法如下：0.048mol／L BaCl2 0.5ml0.18mol／L H2SO4 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
使用前剧烈摇动，若出现大颗粒，应更换，有效期为6个月。
二、操作方法1．制备接种菌液：临床标本中分离的细菌做药敏试验，应挑取已分离提纯的菌落4～5个制备菌悬液。
制备菌液的方法是挑选琼脂平板上、形态相同的菌落移种于M —H液体培养基中，置35℃水箱中孵育4小时，校正浊度，或用接种环挑取菌落，悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
此法制备接种菌液适用于任何细菌。
2．接种平板：制备好的接种菌液必须在15min内使用。
用灭菌的棉拭子蘸取菌液；在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。
用棉拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平板周边绕两圈，保证涂布均匀。
3．贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片（开盖晾3—5min）。
用镊子取一张纸片，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。
每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
直径为90mm的平板最好不超过6张，直径150mm的平板最好不超过15张。
贴上纸片后，须在15min内倒过来放35℃孵箱培养。
不可放在CO2环境中。
4．孵育：必须用35℃孵箱，平板在孵箱内最好单独摆放，不超过二个叠在一起，否则中间的平板，达不到孵箱温度而产生预扩散的作用，平板孵育18～24h后，读取结果。
5. 判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径。
抑菌环应为正圆形，且包括纸片直径（测量垂直方向取平均值）。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
影响因素:临床中药物敏感性试验主要受到抗菌药物、培养基、细菌、试纸片以及培养条件等因素的影响。
1、药物因素纸片法药敏试验的结果主要受到药物理化性质以及其作用特点等因素的直接影响。
1.1药物理化性质药物理化性质影响药敏结果的因素有：药物溶解性、稳定性等。
1.1.1药物溶解性：药物的溶解性从易溶到极微溶于水不等，易溶于水的药物制成药敏试纸片后在培养基上很容易均匀扩散，而极微溶于水的药物制成药敏片后在培养基上很难完全溶解于培养基中并扩散。
当药物试纸片放置到培养基上之后，不同溶解性的药物在规定的培养时间内扩散到培养基中的程度是不相同的，有的能完全扩散到培养基中，而有的却不能完全扩散，这必然导致该药物的抑菌效果低于真实值。
所以，药物溶解性的高低可以影响药物敏感性试验的结果的真实性，极微溶于水的药物的抑菌环可能低于其真实抑菌效果。
常用溶解度较高的药物有：氨基糖苷类药物的盐类（硫酸阿米卡星、庆大、链霉素等）、头孢霉素盐类（头孢曲松钠、头孢氨苄、头孢噻肟钠等）、青霉素盐类、喹诺酮类等；而常用的低溶解度的药物有：氟苯尼考、红霉素、杆菌肽锌、北里霉素、呋喃托因、两性霉素等。
1.1.2药物稳定性的影响：临床中常用的药物试纸片一般是事先加工好的，极少是现用现做的，所以药品试纸片中药物含量必然受到其稳定性的影响。
有些药物如：青霉素类、红霉素以及部分头孢菌素在自然条件下是非常不稳定的，它们的效价易受到光照、溶剂、PH 值以及温度等诸多因素的影响而降低。
如青霉素钠或钾无论在酸性还是在碱性溶液中都会迅速分解，所以在加工药敏试纸片过程中以及将试纸片放置到培养基上时，溶剂和培养基的PH值都会造成药物效价的降低和药敏结果的降低。
红霉素也是一种很不稳定的药物，它在弱碱情况下较为稳定，但是当PH小于6时红霉素会很快分解，导致药敏试验结果的降低。
另外，许多药物还会受到光照、温度以及储存时间等多种因素的影响而导致抗菌效价降低。
1.2药物作用特点药物敏感试验结果还受到药物本身作用特点的影响，如药物抗菌作用机理、药物作用适宜PH值、药物有效部位以及各种离子的影响等。
这些因素在一定程度上可以导致抑菌环的变大或变小，在临床中也是不可忽视的因素。
1.2.1药物抗菌作用机理：临床中的抗菌药物可以简单的分成抑菌药物和杀菌药物两种。
杀菌药物是指药物可以直接作用于细菌静止期和繁殖期将细菌杀灭；而抑菌药物是通过竞争抑制或其他机理只杀灭处于繁殖期的细菌，而对静止期的细菌没有杀灭作用。
由于抑菌药物和杀菌药物对细菌的作用机理不相同，所以纸片法药敏试验时产生的抑菌环（带）的边沿是不相同的。
杀菌药物产生的抑菌环边沿一般是非常明晰清楚，而抑菌药物产生的抑菌环边沿是模糊的，这主要是因为药物扩散后在边沿处的浓度只能杀死部分细菌（或者使细菌形成L型），在边沿处细菌的不同形态形成了模糊的过渡带。
所以在药敏试验结果判断上，抑菌药物和杀菌药物抑菌环（带）大小很难确定，并且随着培养时间的延长和药物的失效，抑菌药物抑菌环（带）边沿未被杀死的细菌有可能又恢复生长，从而导致抑菌环（带）的进一步缩小。
药物的抑菌与杀菌作用可以导致药敏试验结果判断的不准确性。
临床中常用的抑菌药物有：青霉素类、头孢类、磺胺类、红霉素类、杆菌肽（锌）、林可霉素、四环素类（土霉素、金霉素等）、氯霉素（氟苯尼考）等；杀菌性药物有：氨基糖苷类（阿米卡星、庆大霉素等）、喹诺酮类（氧氟沙星、恩诺沙星等）等。
1.2.2作用适宜PH值：临床中许多药物的疗效很大程度上受到溶剂PH的影响。
药物的作用可能因为溶剂PH值的改变而加强或减弱，即药物的作用强弱存在最适宜的PH值。
当然这类药物的试纸片也很容易受到培养基PH值的影响。
如：氨基糖苷类<3>在弱碱情况下抗菌作用稍有增强；而呋喃托因和呋喃坦啶在酸性条件下比碱性条件下杀菌作用强（PH5时比PH8时分别强100倍、800倍）。
1.2.3药物有效部位：有些药物的抗菌作用是不能通过体外药敏试验来判断的，如：乌洛托品、部分中药提取物（穿心莲内酯）等，这些药物在体外一般没有抗菌作用或抗菌作用相当低，它们只有在体内进一步分解（或转化）后才能表现出抗菌作用，所以检测这类药物的抗菌作用是不能通过抑菌环大小来判断的。
这类药物还有：鞣酸黄连素、金荞麦等。
1.2.4离子的影响：常用的许多药物可以受到各种离子的影响而导致抗菌作用降低甚至丧失。
如：喹诺酮类药物、氨基糖苷类、土霉素、金霉素、妥布霉素、泰乐菌素等药物在Ca2+、Mg2+、Al3+等阳离子的作用下（一般是形成不溶性络合物）抗菌作用降低或丧失；许多重金属离子（铜、锌、汞）等可以破坏青霉素钠(或钾)的活性，使其抗菌作用降低。
在药敏试验培养基中如果含有大量这些阳离子就可以直接导致以上药物的抑菌环（带）减小甚至消失，所以在进行药物敏感性试验时应该选用无离子水和高质量的营养琼脂。
1.2.5其他因素：药物自身性质影响因素还包括药物蛋白结合率、作用温度等多方面因素。