凝胶色谱、亲和色谱研究进展及案例
什么是凝胶色谱法原理及应用实例
什么是凝胶色谱法原理及应用实例
凝胶色谱法，又称为凝胶色谱技术，是一种在六十年代初发展起来的快速且简单的分离分析技术。
它的原理基于分子排阻的原理进行分离。
这种方法的设备简单，操作方便，且不需要有机溶剂。
对于高分子物质，凝胶色谱法具有很高的分离效果。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
至于应用实例，抱歉目前无法提供，建议阅读生物化学类专业书籍或者请教该领域的专家。
凝胶色谱亲和色谱研究进展及案例
凝胶色谱亲和色谱研究进展及案例凝胶色谱和亲和色谱是生物化学领域中常用的分离和纯化技术。
在过去几十年中，这两种技术已经取得了重要的研究进展，并成功应用于各种生物分子的纯化和研究中。
凝胶色谱是一种分子大小分离和纯化技术，基于分子在凝胶基质中的大小排列原理。
凝胶基质通常是一种由交联聚合物构成的固体材料。
凝胶色谱的主要原理是根据分子在凝胶中的弥散速率不同来实现分离纯化。
大分子会比小分子更慢地穿过凝胶基质，从而实现分子大小的分离。
由于凝胶色谱非常温和，适用于分离和纯化各种生物大分子，如蛋白质、核酸和多糖。
近年来，凝胶色谱的研究进展主要集中在凝胶基质的改良和优化上。
一项研究使用了新型聚合物材料制备的类孔洞凝胶，提高了溶剂的渗透性，从而加快了分子的弥散速率，实现了更快的分离速度。
另一项研究则利用凝胶微粒内部的导体结构，实现了电场改性的凝胶色谱，提高了分离效果和分辨率。
亲和色谱是一种将目标生物大分子与固定相之间特定的相互作用用于分离纯化的技术。
固定相通常是一种具有特定亲和性的配体，可以选择性地结合目标分子。
亲和色谱的原理是通过结合-解离循环，将目标分子与杂质分子进行选择性分离。
近年来，亲和色谱的研究进展主要集中在配体的开发和优化上。
一项研究使用了新型功能性高分子材料作为固定相，开发了具有高亲和性和选择性的亲和色谱柱，用于蛋白质的纯化。
另一项研究则通过表面改性技术，将金属离子固定在亲和色谱柱表面，实现了对金属离子亲和性蛋白的高效纯化。
总之，凝胶色谱和亲和色谱是生物化学领域中重要的分离和纯化技术。
在过去几十年中，这两种技术取得了重要的研究进展，并成功应用于各种生物分子的纯化和研究中。
随着不断的技术改良和优化，凝胶色谱和亲和色谱将在生物学研究中发挥越来越重要的作用。
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法的原理和目的
凝胶色谱法是一种分离和分析生物大分子的常用方法，其原理是利用凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）作为固定相，通过分子在凝胶中的大小和形状差异，使样品分子在凝胶中以不同的速率进行迁移，从而实现分离。
目的是通过凝胶色谱法可以实现以下几个目标：
1. 分离和纯化目标分子：凝胶色谱法可以将混合的生物大分子混合物分离成单一的成分，从而实现对目标分子的纯化。
2. 获得目标分子的大小和形状信息：不同大小和形状的分子在凝胶中的迁移速率不同，通过测定其迁移距离或迁移时间，可以获得目标分子的大小和形状信息。
3. 分析样品中不同组分的含量和相对分子量：通过凝胶色谱法可以定量分析样品中不同组分的含量，并通过与已知相对分子量的标准物质进行比较，可以得到目标分子的相对分子量。
总之，凝胶色谱法是一种用于分离和分析生物大分子的常用方法，既可以用于纯化目标分子，又可以获得目标分子的大小、形状以及相对分子量等信息。
凝胶色谱技术
凝胶色谱技术凝胶色谱法凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
一、基本理论（一）分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
具有多孔的凝胶就是分子筛。
各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。
两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。
直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。
如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。
因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。
综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。
大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。
琼脂糖凝胶CL-6B亲和色谱法一步纯化蚯蚓半乳凝素
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凝胶色谱实验报告
凝胶渗透色谱法测定聚合物的平均分子量及其分布一．实验背景简介1.聚合物分子量及其分子量分布聚合物性能的最主要参数之一，与聚合物力学性能有密切关系，对聚合物拉伸强度以及成型加工过程，如模塑，成模，纺丝等都有影响，研究聚合物的分子量及其分子量分布，对于控制改进产品质量具有重要意义。
2.凝胶渗透色谱法利用分子溶液通过填充有某种凝胶的柱子，把聚合物分子按照尺寸大小进行分离的方法。
目前是测定聚合物分子量及其分子量分布最有效的方法。
它具有测定速度快、用量少、自动化程度高等优点，已获得广泛应用。
二．实验目的1. 了解凝胶渗透色谱的原理；2. 了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术；3. 测定聚苯乙烯样品的分子量分布。
三．实验原理凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC 的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物种不同分子量的高分子组份。
当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。
一般认为，GPC/SEC 是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。
高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。
当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。
由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。
凝胶色谱法创新实验报告
一、实验背景凝胶色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC）是一种常用的分离和表征高分子材料的方法。
该方法利用高分子材料分子量的大小差异，通过凝胶色谱柱进行分离，从而实现对高分子材料的分子量及其分布的测定。
近年来，随着高分子材料研究的不断深入，凝胶色谱法在材料科学、生物工程、食品工业等领域得到了广泛应用。
然而，传统的凝胶色谱法存在一些局限性，如分离效率低、操作复杂、样品用量大等。
为了解决这些问题，本研究对凝胶色谱法进行了创新实验，旨在提高分离效率、简化操作流程、降低样品用量。
二、实验目的1. 探索新型凝胶色谱柱材料，提高分离效率；2. 研究新型分离介质，简化操作流程；3. 开发低样品用量凝胶色谱法，降低实验成本。
三、实验方法1. 新型凝胶色谱柱材料的研究（1）选取具有良好孔隙结构和化学稳定性的新型凝胶材料，如聚苯乙烯、聚丙烯酸等；（2）通过溶胶-凝胶法制备凝胶色谱柱填料；（3）对制备的凝胶色谱柱填料进行表征，包括孔径分布、比表面积、热稳定性等；（4）将新型凝胶色谱柱填料应用于凝胶色谱实验，比较其分离效果与传统色谱柱填料的差异。
2. 新型分离介质的研究（1）选取具有良好溶解性和低粘度的有机溶剂，如乙腈、甲醇等；（2）研究新型分离介质对高分子材料分子量及其分布的分离效果；（3）比较新型分离介质与传统分离介质的分离性能。
3. 低样品用量凝胶色谱法的研究（1）优化实验条件，降低样品用量；（2）研究低样品用量对凝胶色谱实验结果的影响；（3）开发适用于低样品用量凝胶色谱法的实验流程。
四、实验结果与分析1. 新型凝胶色谱柱材料的研究实验结果表明，新型凝胶色谱柱填料具有较好的孔隙结构、化学稳定性和分离效果。
与传统色谱柱填料相比，新型凝胶色谱柱填料的分离效率提高了20%，且操作简便。
2. 新型分离介质的研究实验结果表明，新型分离介质对高分子材料分子量及其分布的分离效果良好。
与传统分离介质相比，新型分离介质的分离效率提高了15%，且具有良好的溶解性和低粘度。
凝胶色谱层析纯化技术
凝胶色谱层析纯化技术
凝胶色谱层析纯化技术是一种常用的分离和纯化生物分子的方法，主要用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸和其他生物大分子。
凝胶色谱层析技术根据分离物质的尺寸和形状选择合适的凝胶材料，通过分子在凝胶孔隙中的扩散速率以及与凝胶之间的亲疏水性质之间的交互作用来实现分离。
凝胶色谱层析纯化技术主要分为两种类型：分子筛层析和配体亲和层析。
在分子筛层析中，分离物分子根据其尺寸通过凝胶层析柱，大分子在凝胶中的扩散速度较慢，因此会稍微滞留，而小分子则通过凝胶层析柱较快。
这种方法可以实现按分子大小分离的纯化。
而在配体亲和层析中，凝胶上有特定的配体，可以与目标分子的特定结构或动力学性质发生特异性结合，从而达到分离和纯化的目的。
凝胶色谱层析纯化技术在生物分离纯化领域具有广泛的应用，例如可以用于蛋白质的分离与纯化，并能够提供高纯度、高稳定性的蛋白样品。
此外，凝胶色谱层析还可以用于核酸纯化、多肽纯化等生物大分子的纯化工作。
凝胶色谱层析技术具有操作简单、分离效果好、灵活性高等优点，因此被广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
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1924 年，俄罗斯学者 Engelhardt提出了“固定化配体原理”，作为分离生物活性物质 的方法，为亲和色谱分离方法的根本。
1970 年，Cuatrecases 提出了“空间间隔臂”概念和方法，成功解决了配位体的立体 可接受性问题。
金属有机骨架化合物（MOFs）因具有比表面积大、结构多样性、孔道尺寸可调、骨架 可修饰、热稳定性和化学稳定性良好等优点而广泛应用于分离分析等领域。西班牙 Balearic Islands大学的 Palomino课题组利用注射器设计了一种针管式自动磁性 （MOFs ）分散固相微萃取装置。
固定相
多孔整体材料作为一种新型分离介质，由于其具有制备简便、通透性好、性能稳定和 易于修饰等特点而被誉为第四代色谱分离介质。邹汉法课题组发展了一种基于光引发 巯基－丙烯酸酯点击聚合反应的新方法，并成功制备了具有高分离性能的有机－硅胶 杂化整体柱。与巯基－烯和巯基－甲基丙烯酸酯点击聚合反应相似，光引发的巯基－ 丙烯酸酯点击聚合反应不仅反应效率较高，速度快，而且反应条件非常温和。
分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子有特异性识别材料的技术。由于蛋 白质体积大、结构复杂、易于变性，完整蛋白质模板分子难以获得且价格昂贵，因此 限制了蛋白质分子印迹材料的发展。中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员课 题组提出了一种蛋白质抗原决定基分子印迹磁性纳米材料的制备新方法。抗原决定基 印迹是以目标蛋白质上一段特异性多肽为模板分子进行印迹。由于模板肽段与目标蛋 白质间存在极强的特异性，形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白质均具有特异性识 别能力。
1、中国色谱发展概况
色谱归属于分析化学中的一个 分支，其出现及发展至今已将 近 110 年。色谱技术在生物制 药、蛋白质组学、生物分子的 分离分析方面都发挥着越来越 重要的作用。
20 世纪末至今，是中国色谱学 科全面快速发展的重要时期。 Web of Science 数据库和“中 国期刊全文数据库”和“万方数 据库”的检索数据( 2019 年9 月 25 日检索) 表明，1990 年至 2019 年我国科技工作者在美国 科学情报研究所科学引文索引 收录期刊( 即 SCI 期刊) 和中国 科技期刊上发表色谱相 关 论 文 132604 篇 ( 其 中 SCI 期 刊 论 文27381 篇，中国科技 期刊数据库论文 105223 篇) 。
分析检测
澳大利亚悉尼大学的 Handelsman小组采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯作为雌激素衍生化 试剂，建立了一种利用LC-MS/MS同时测定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睾 酮(T)、二氢睾酮(DHT)的高灵敏检测方法。
蛋白质组学
美国 Wisconsin-Madison大学的Ge小组耦合离子交换色谱/疏水色谱/反相色谱(IEC-HICRPC)3种色谱分离方法，构建了三维液相色谱(3D LC)用于整体蛋白质的分离，并证明 3D LC(IEC-HIC-RPC)技术优于传统的 2D LC(IEC-RPC)。
实验方法
材料：新鲜猪血，柠檬酸三钠，氯化铜，丙酮，聚丙烯酸（PAA），不同相对分子质 量聚丙烯酸钠（PAAS），固含 3.45%（质量分数）；壳聚糖，脱乙酰度≥90%，；SOD 活性试剂盒， 低相对分子质量标准蛋白质，SOD 标准品，临苯三酚，SephedexG-75， DEAE-sepherose-fast flow4B。
婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的测定
2、亲和色谱
文章名：《亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展》 作者：冯颖淑1，童珊珊2，徐希明2等 作者单位：1中国药科大学 2江苏大学 发表期刊：《中国中药杂志》 发表时间：2019年
亲和色谱法( affinity chromatography) 是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱 方法。
α-乳白蛋白检测方法
方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE) 反相高效液相色谱
(RP-HPLC) 离子交换液相色谱
(FPLC)
毛细管凝胶电泳 (CGE)
液相色谱-质谱联用 (LC-MS)
优点 普适性最强 快速高效精准、重现性稳
定 快速高效精准
定量分析可靠
灵敏度高、稳定性好
缺点
操作复杂，测定周期长， 重现性差，只能半定量。
涉及毛细管电 泳（CE）、 气象色谱（ GC）高效液
相色谱（ HPLC）论文
增长态势
2、最新动态
样品前处理
膜蛋白的疏水性强、溶解性差和丰度低，对它的分离分析是蛋白质组学中的一大难题。 复旦大学的刘宝红教授课题组采用壳聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作为纳米反 应器，从有机溶剂中高效富集疏水性膜蛋白并进行原位酶解。将该技术应用于实际样 品中膜蛋白的分析鉴定，采用二维液相色谱－质谱方法(2D-LC-MS)可鉴定 931种膜蛋 白，而通常采用的水溶液中酶解法仅能鉴定 73种膜蛋白。结果表明多功能的MGF-CS 对蛋白质组学中膜蛋白的分析鉴定具有重要的应用价值。
选择色谱柱
α-乳白蛋白的相对分子质量为14200 u，而凝胶色谱柱TSK-2000SWXL分离样品的相对 分子质量范围为5000~150000 u，因此选择此色谱柱是比较合适的。组成蛋白质的氨 基酸在210~280 nm范围内都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280 nm有足够高的 吸收，而α-乳白蛋白含有丰富的色氨酸，因此选择280 nm作为DAD的检测波长，能 获得较好的灵敏度。
1975 年proath首次提出固定化金属螯合亲和层析（IMAC），利用固定在基质上的过渡 态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的配位作用，来实现对 金属离子有亲和力的蛋白质的吸附和分离。在制备亲和介质时，常用的金属离子有 Cu2+，Zn2+和 Ni2+等， 常用的螯合配基有亚氨基二乙酸 （IDA）， 三羧基甲基乙二胺 （TED），次氨基三乙酸（NTA）等。 固定化螯合亲和色谱常常以凝胶为载体， 如在 SephadexG-75 或者DEAE-superpose 等凝胶上用化学交联方法引入螯合剂 IDA， 再通过 交联固定和亲和配 （Ba2+，Cu2+，Zn2+）。 用该方法制备的凝胶介质生产成本很高， 软基质很易被压缩，不易被放大生产。
只能检测出天然的α-乳白 蛋白
需要预先 把要乳清蛋白与酪蛋白分
离才可以进行
蛋白质容易在石英毛细管 上吸附，影响分离效
率，甚至堵塞毛细管柱
只能检测非变性的α-乳白 蛋白
凝胶过滤色谱：根据蛋白质相对分子质量大小进行分离，紫外吸收检测。能检测出 婴儿配方乳粉中非变性和在加工过程中变性的α-乳白蛋白总量，操作简单，准确度 高。
流动相：6 mol/L盐酸胍溶液，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA，调pH=6.0，用 0.45 μm滤膜过滤。
色谱条件：色谱柱TSK-2000SWXL凝胶色谱柱(7.8mm×300 mm)；柱温30 ℃；流动 相流速0.5mol/L；检测波长280 nm。
（日本TOSOH公司生产的TSK-2000SWXL粒度5μm，孔径125，可以测量分子量5,000～150,000。）
回归方程和检出限
称取适量α-乳白蛋白标准品，用流动相配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的标准系列，按 照1.3所述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，做标准曲线，得 到α-乳白蛋白线性回归方程：Y=8407.6X-90.26，线性相关系数：R2=0.9998。以信噪 比S/N=3计算α-乳白蛋白的检测限为2.8 μg/mL，完全能满足婴儿配方乳粉中α-乳白蛋 白含量的测定。
色谱方法应用于化学领域的论文数量占46%，生物化学与分子生物学领域的占 21%， 食品科学与技术领域的占 5%，材料科学、工程学、微生物学领域的各占 4%，环境科 学、光谱学和药理学领域的各占 3%，上述领域之外的论文比例为 8%。
1990 年至 2019 年，中国科学家所发表的色谱领域论文总数以 28062 篇的数量居世界 第三位( 第一名: 美国，71008 篇; 第二名: 日本，35 035 篇) 。2019 年发表论文 4146 篇，2019 年发表 4574 篇，排名跃居世界第一。
实验方法
准确称取含有大约相当于10 mg蛋白质的样品，样品溶在盛有流动相溶液的10 mL容量 瓶中，超声处理30 min。从以上样品中转移1.5 mL于10mL离心管中，加入10 μL β-硫 基乙醇，摇动混合约10 s，让样品在室温下放置至少2 h，用0.45μm微孔滤膜过滤至 液相色谱进样瓶中，然后注射进液相色谱。根据标样峰面积和浓度建立标准曲线， 从而计算样品中α-乳白蛋白含量。
文章名：《壳聚糖螯合凝胶层析法纯化血液超氧化物歧化酶》 作者：王保，全平娟 ，张永州等 作者单位：河南大学，中科院生物物理研究所，兰州大学 发表期刊：《食品与生物技术学报》 发表时间：2019年
研究背景
超氧化物歧化酶简称 SOD，是广泛存在于生物体内的一种可防止氧化损伤和缺失的活 性酶，也是一种应用广泛的药用酶，具有抗衰老、预防辐射及治疗炎症等一系列功能 ，已经被广泛应用于食品及医药卫生行业。
近年来，随着基因工程下游技术的发展，基因重组蛋白质的分离纯化技术越来越显示 其重要性， 金属螯合层析技术（IMAC）分辨率高、选择性好，能在常规的变性条件 下及非变性条件下进行蛋白质组分分离纯化。
作者以壳聚糖为原料， 以固定相偶联的配基-亚氨基二乙酸（IDA）及金属离子 Cu2+发 生螯合作用，制得金属亲和层析凝胶，改凝胶化学稳定性好，基质稳定，容易再生， 并首次以聚合高分子电解质聚丙烯酸钠对传统血液超氧化物歧化酶提纯工艺进行改进 。
二、凝胶、亲和色谱案例分析
1、凝胶过滤色谱（凝胶色谱分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱）