第七章 亲和层析技术
合集下载
第七章亲和层析
特定抗原
酶 受体、结合蛋白 脱氢酶、激酶、干扰素、聚合酶、限制酶等 凝聚因子、脂酶、某些蛋白酶、DNA聚合酶 等 糖蛋白
对应单克隆或多克隆抗体
对应底物、辅酶、抑制剂 对应信号分子、效应物 染料配体 肝素 凝集素、苯基硼酸盐
高
高 高 低 低 低
凝集素、糖苷酶
核酸
对应糖
核酸结合蛋白、互补链
高
高
13
第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
11
第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
用于制备亲和吸附剂的配体应满足亲和性、特异性要 求;当偶联到载体上时,不妨碍其与目标分子的结合;在 将配体固定化时，应保证其与载体形成稳定的共价键， 不至于从载体上脱落下来.
12
第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
亲和层析中的合适配体
待纯化的生物分子 特定抗体 抗体/免疫球蛋白 配体 对应抗原 蛋白质A/蛋白质G 特异性 高 低
8
第七章 亲和层析 第二节 亲和层析配体
二、亲和配体的类型 亲和配体主要分为专一性小分子配体、基团特异性小 分子配体、专一性大分子配体和基团特异性大分子配 体。 专一性小分子配体包括固醇类激素、维生素和特定酶 抑制剂等 . 基团特异性小分子配体的种类最多，包括许多酶的辅 助因子及其类似物，以及仿生染料、硼酸衍生物和许 多氨基酸、维生素等
将配体固定化到载体上后，需检测一下配体的浓度， 以判断偶联过程成功与否。测定偶联上的配体的浓度 有这样几种方法： 1）差示分析法：用加入的配体量减去洗脱液中游离 配体量，即可得出偶联上的配体量。
25
第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
2）直接测定法：直接测定制备好的亲和吸附剂上配 体的浓度。可以根据配体的性质用分光光度法、蛋白 质测定方法或特定基团测定方法来测定。 3）放射分析法：对于具有放射活性的配体，可以很 灵敏地测出固相化配体的浓度。 4）水解法：当配体的测定不受大量的载体水解产物 干扰时，可以用此法测定亲和吸附剂上配体的浓度。 水解的方法可视配体、载体的偶联情况而定，可以采 用酸水解或酶水解。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
海南大学农学院wss24
06.05.2021
海南大学农学院wss25
四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
06.05.2021
海南大学农学院wss21
专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
06.05.2021
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
06.05.2021
海南大学农学院wss7
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
海南大学农学院wss39
第七章 层析分离技术(4)亲和层析
样品需进行预处理：通过离心或超滤除去微小颗粒； 缓冲液离子强度： 载体活化时引入一些带基团，低离子强度下，树脂对杂质的静电作用较 强，因此，提高盐浓度可减少杂质的非特异性吸附； 在离子强度太高的情况下，由于间隔臂上的碳氢链疏水性增强，也可能 产生非特异性吸附 因此，缓冲液的离子强度应适中（100~500mmol/L）
pH值：决定了蛋白质与配体分子的构象，在整个吸附和解吸过程都 至关重要（需进行优化）； 在料液中加入表面活性剂（尤其适用于目标物为疏水性强的蛋白 质）； 料液流速是影响色谱柱效和分离速度的重要因素 提高流速可提高分离速度，但柱效降低。应综合考虑。 料液流速与操作压力成正比，需根据吸附柱的不同载体来选择。
硅胶的分类（常以孔径大小来分）：
应用：吸附层析剂与分配层析剂
优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离， 可用在水溶液中或有机溶剂中
7.4 亲和层析
二、亲和层析的基本组成
2. 配体与目标物
①酶-底物类似物，抑制剂，辅因子；
谷胱甘肽-谷胱甘肽-S-转移酶（GST），GST融合蛋白
琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构 a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构
介质商品种类
Sepharose 2B（2%） Sepharose 4B（4%） Sepharose 6B（6%）
经过交联而增加机械强 度的琼脂糖
Sepharose CL-2B Sepharose CL-4B Sepharose CL-6B
第七章 层析分离技术（4）
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相层析
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
第7章 亲和层析
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
第一节 基本原理
欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质 L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离 的络合物L—S，其中的L又能与活化的基质M 之间能可逆地结合与解离的原理发 展起来的层析法。
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、特殊性洗脱
亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法
六、亲和层析柱的再生
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
2、专一性洗脱
7 亲和层析
②根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开， 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计 算出配体的含量） 算出配体的含量）
四、特异性吸附
当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时， 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入， 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在， 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带， 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不 同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 亲合力 还与样品的pH值 离子强度和反应时间有关 外，还与样品的 值、离子强度和反应时间有关 例1 图7-6，Sepharose-έ氨基乙酰 色氨酸甲酯亲和层析研究发现 ， 氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现 氨基乙酰 条件下， ①在高pH条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高 条件下 吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大 ②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小 在高离子强度条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量小 亲和层析柱分离γ-球蛋白时 例2 用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应 比3h 亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应1h比 得率高
第七章 亲和层析技术
第2章亲和层析1 亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。
在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。
所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。
将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。
将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。
图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。
根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。
表2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。
(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。
(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。
且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。
目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。
一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。
现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1 亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。
亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。
亲和层析
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
操作流程
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响； 4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。
即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质 ( 如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
2016/8/27 18
（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质 : 特殊配基和通用配 基。 • 特殊配基（special ligand）
2016/8/27
• 主要用于分离与核酸有关的物质。
2016/8/27
10
2、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为 Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。
• 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种 功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 • Sepharose CL,稳定性明显增加，能在 pH3~14中应用。
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物 活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
2016/8/27
21
（一）、糖类载体活化与偶联
• • • • • 溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
2016/8/27
22
溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。 • 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
• 利用生物大分子物质具有与某些相应 的分子专一性可逆结合的特性而建立 的层析技术。 • 适用于从成份复杂且杂质含量远大于 目标物的混合物中提纯目标物。
2016/8/27 4
特点(p145)
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ；
• 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度 快、分离效果好、分离条件温和； • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小 分子配基更明显。 • “手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。 • 常用的“手臂”多为烃链 。
2016/8/27 41
（三）、配基与载体的结合位点的影响
• 多肽或蛋白质等大分子配基
• 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能 基团与载体连接。 • 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附 剂具有较大的亲和力。
亲和色谱
• 利用生物分子间的特 异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯 化的技术称为亲和纯 化技术（Affinity purification）
2016/8/27
1
技术要点
• （1）找与底物专一 可逆结合的配基； • （2）将配基通过共 价键偶联到基质； • （3）配基与底物吸 附； • （4）洗脱目标物。
37
5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102
• CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； • Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 • Affi-Gel202 具有 10 个原子的“手臂”，未端具 有羧基；
2016/8/27
38
五、 亲和层析的影响因素
• • • •
• 5、多孔玻璃珠：
• 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱 性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基 团少。
• 6、其它载体(p147)
2016/8/27
13
三 、 亲和配基
• • • • • • 理想配基的特点(p149)* 配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型
(p153)
• • • • • （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基 配基的连接
2016/8/27
44
七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
2016/8/27
45
（一）、影响吸附的条件
• 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加 1mol/L 的亚 硝酸，反应液搅90s； • 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
2016/8/27
31
重氮化法
• ω- 氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得 对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 • 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 • 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
19
通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配 基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时 的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
2016/8/27 20
四、 载体的活化与偶联
• • 改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
• 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl－<I－<CF3COO－<SCN－ <CCl3COO－。 • 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
2016/8/27 2
亲和纯化技术
• • • • • • 亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
2016/8/27
3
亲和层析 (affinity Chromatography)
2016/8/27 7
二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
• • • • • （1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
2016/8/27
8
（二）、常用载体
• 亲和吸附剂及配体的性质 • 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析 流速有关。
• • • • 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
2016/8/27
46
非专一性吸附
• 亲和层析中的非专一性吸附。 • • • 离子效应 疏水基团 复合亲和力
2016/8/27
42
• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 • • • • （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
2016/8/27
43
六、 配基与间隔臂的连接
2016/8/27 11
• 3、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小， 应用受到限制。 • 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
2016/8/27 12
2016/8/27
16
（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。 • AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，对 脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛 3-磷酸脱氢酶有吸附力。
2016/8/27
17
（四）、配基分子的大小
2016/8/27
47
离子效应
• 配基与载体-间隔臂的不 完全结合，将无关离子 基团引入吸附剂。 • 具有离子基团的亲和吸 附剂会影响蛋白质的洗 脱行为。
2016/8/27
48
疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
2016/8/27
28
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
2016/8/27
29
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。
• 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
2016/8/27
30
叠氮化法
2016/8/27
23
方法
2016/8/27
24
高碘酸氧化法
• 多糖载体与 0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应 24 小 时会产生醛； • 在温和条件下，醛与赖氨酸上的 ε-NH2 生成希 夫 碱 ，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基 胺。
2016/8/27
25
环氧化法
• 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用 生成环氧化合物； • 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
2016/8/27
26
甲苯磺酰氯法
• 甲苯磺酰氯法 • 在无水丙酮中进行。
• 优点：①活化反应迅速； • ②偶联条件温和； • ③偶联效率高。
2016/8/27
27
双功能试剂法
• 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 • 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 • 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、 酚、醇类等偶联。 •
2016/8/27
14
（一）、配基的选择
• 亲和层析配基的选用主要取决于分离对 象。 • 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲 和势），KL 在10-4～10-8之间。 • 2、配基与配体的结合应是专一的 。 • 3、配基应具有化学活性 。
2016/8/27
15
（二）、配基的浓度
• 对 亲 和 势 比 较 低 的 时 候 （ KL≥104mol/L ），增加配基浓度有利于吸 附。 • 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱 困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
2016/8/27 18
（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质 : 特殊配基和通用配 基。 • 特殊配基（special ligand）
2016/8/27
• 主要用于分离与核酸有关的物质。
2016/8/27
10
2、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为 Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。
• 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种 功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 • Sepharose CL,稳定性明显增加，能在 pH3~14中应用。
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物 活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
2016/8/27
21
（一）、糖类载体活化与偶联
• • • • • 溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
2016/8/27
22
溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。 • 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
• 利用生物大分子物质具有与某些相应 的分子专一性可逆结合的特性而建立 的层析技术。 • 适用于从成份复杂且杂质含量远大于 目标物的混合物中提纯目标物。
2016/8/27 4
特点(p145)
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ；
• 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度 快、分离效果好、分离条件温和； • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小 分子配基更明显。 • “手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。 • 常用的“手臂”多为烃链 。
2016/8/27 41
（三）、配基与载体的结合位点的影响
• 多肽或蛋白质等大分子配基
• 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能 基团与载体连接。 • 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附 剂具有较大的亲和力。
亲和色谱
• 利用生物分子间的特 异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯 化的技术称为亲和纯 化技术（Affinity purification）
2016/8/27
1
技术要点
• （1）找与底物专一 可逆结合的配基； • （2）将配基通过共 价键偶联到基质； • （3）配基与底物吸 附； • （4）洗脱目标物。
37
5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102
• CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； • Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 • Affi-Gel202 具有 10 个原子的“手臂”，未端具 有羧基；
2016/8/27
38
五、 亲和层析的影响因素
• • • •
• 5、多孔玻璃珠：
• 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱 性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基 团少。
• 6、其它载体(p147)
2016/8/27
13
三 、 亲和配基
• • • • • • 理想配基的特点(p149)* 配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型
(p153)
• • • • • （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基 配基的连接
2016/8/27
44
七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
2016/8/27
45
（一）、影响吸附的条件
• 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加 1mol/L 的亚 硝酸，反应液搅90s； • 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
2016/8/27
31
重氮化法
• ω- 氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得 对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 • 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 • 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
19
通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配 基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时 的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
2016/8/27 20
四、 载体的活化与偶联
• • 改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
• 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl－<I－<CF3COO－<SCN－ <CCl3COO－。 • 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
2016/8/27 2
亲和纯化技术
• • • • • • 亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
2016/8/27
3
亲和层析 (affinity Chromatography)
2016/8/27 7
二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
• • • • • （1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
2016/8/27
8
（二）、常用载体
• 亲和吸附剂及配体的性质 • 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析 流速有关。
• • • • 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
2016/8/27
46
非专一性吸附
• 亲和层析中的非专一性吸附。 • • • 离子效应 疏水基团 复合亲和力
2016/8/27
42
• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 • • • • （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
2016/8/27
43
六、 配基与间隔臂的连接
2016/8/27 11
• 3、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小， 应用受到限制。 • 4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
2016/8/27 12
2016/8/27
16
（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。 • AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤 N6- 氨基接到载体上，对 脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛 3-磷酸脱氢酶有吸附力。
2016/8/27
17
（四）、配基分子的大小
2016/8/27
47
离子效应
• 配基与载体-间隔臂的不 完全结合，将无关离子 基团引入吸附剂。 • 具有离子基团的亲和吸 附剂会影响蛋白质的洗 脱行为。
2016/8/27
48
疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
2016/8/27
28
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
2016/8/27
29
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。
• 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
2016/8/27
30
叠氮化法
2016/8/27
23
方法
2016/8/27
24
高碘酸氧化法
• 多糖载体与 0.1mol/L的高碘酸钠氧化反应 24 小 时会产生醛； • 在温和条件下，醛与赖氨酸上的 ε-NH2 生成希 夫 碱 ，接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基 胺。
2016/8/27
25
环氧化法
• 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用 生成环氧化合物； • 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
2016/8/27
26
甲苯磺酰氯法
• 甲苯磺酰氯法 • 在无水丙酮中进行。
• 优点：①活化反应迅速； • ②偶联条件温和； • ③偶联效率高。
2016/8/27
27
双功能试剂法
• 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。 • 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 • 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、 酚、醇类等偶联。 •
2016/8/27
14
（一）、配基的选择
• 亲和层析配基的选用主要取决于分离对 象。 • 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲 和势），KL 在10-4～10-8之间。 • 2、配基与配体的结合应是专一的 。 • 3、配基应具有化学活性 。
2016/8/27
15
（二）、配基的浓度
• 对 亲 和 势 比 较 低 的 时 候 （ KL≥104mol/L ），增加配基浓度有利于吸 附。 • 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱 困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。