亲和层析技术要点
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。
这种特异可逆结合的物质很多，如抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的这种特异亲和能力又叫亲和力。
亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认为是激素的配体。
其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。
然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。
二、固相载体的选择对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。
一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。
因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。
其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。
连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。
载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。
载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。
再者，载体的组成大小也应均匀。
高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。
配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。
这不是我们所希望的。
一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。
三、配体的选择亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。
配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。
蛋白质亲和层析
蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种高效分离方法，它利用生物大分子之间的特异性作用来选择性地分离目标蛋白质。
该方法具有分离效率高、操作简单易行、适用性强、损失小等优点，被广泛应用于生物化学、生物医学和生物工程等研究领域。
以下针对蛋白质亲和层析的基本概念、方法流程、实验注意事项等进行详细介绍。
一、蛋白质亲和层析基本概念蛋白质亲和层析是利用配体固定于某一介质孔隙中，通过生物大分子之间的特异性作用，选择性地分离目标蛋白质的一种纯化方法。
通常用于分离蛋白质与其结合分子的复合物，例如酶与底物、抗体与抗原等。
常用的配体有亲和素、金属离子、抗体及蛋白质等。
二、蛋白质亲和层析方法流程1. 设计实验流程：确定目标蛋白质及其结合配体，选择适当的分离介质、操作条件及检测方法。
2. 制备分离介质：将选择的配体固定于固相载体（如琼脂糖、琼脂糖-硫酸盐、硅胶等）上。
3. 样品制备：采用适当的方法，“开裂”细胞，释放所需的目标蛋白质。
去除细胞碎片后，可进行酶、抗体等前处理。
4. 样品加载：将制备好的样品加入到分离介质中，充分混合。
5. 洗脱：将非特异性蛋白质等杂质彻底洗脱，最终目标蛋白质作为复合物结合态定向脱附。
6. 脱附和再生：可用特定的洗脱剂或酸碱条件等方法对结合蛋白质进行脱附，目的是复合物的释放以及再生与维护分离介质的性质和活性。
三、蛋白质亲和层析实验注意事项1. 选择适当的配体：根据目标蛋白质特异性、结构、物理化学性质等因素，选择有特异性和较高亲和力的配体。
2. 制备良好的分离介质：要求固相载体颗粒粒径均匀、孔隙适当，配体固定稳定。
3. 样品质量要好：可通过细胞全裂方案、适当的培养培养、存储方式、冻干等方法保证目标蛋白质的活性、纯度和稳定性等。
4. 洗脱过程控制：要严格控制洗脱条件，防止目标蛋白质异常脱失或浓度降低之外，同时要特别关注分离介质稳定性，以维护肯定柱介质活性和再生可能性。
蛋白质亲和层析是一种高效、通用的纯化方法，适用于从复杂基质中分离出目标蛋白质及其复合物。
亲和层析纯化蛋白注意事项
亲和层析纯化蛋白注意事项以亲和层析纯化蛋白注意事项为标题，写一篇文章。
亲和层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过蛋白与配体之间的特异性相互作用，实现目标蛋白的分离纯化。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，有一些注意事项需要我们特别关注。
选择合适的亲和层析柱非常重要。
不同的亲和层析柱具有不同的亲和基团，可以与不同的目标蛋白发生特异性相互作用。
在选择亲和层析柱时，需要考虑目标蛋白的性质，如分子量、等电点、亲和基团的配对等。
同时，还需要考虑目标蛋白与其他非特异性结合物的亲和性，以便在纯化过程中有效去除杂质。
样品的预处理也是亲和层析纯化蛋白的关键一步。
在样品中含有大量的杂质，如其他蛋白、核酸、小分子化合物等。
这些杂质会影响到目标蛋白与亲和基团的结合，降低纯化效果。
因此，在进行亲和层析纯化之前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、浓缩目标蛋白等。
在进行亲和层析纯化蛋白的过程中，温度和pH值的控制也是非常重要的。
温度和pH值可以影响到目标蛋白与亲和基团之间的结合力和特异性。
一般来说，选择适当的温度和pH值可以增强目标蛋白与亲和基团的结合，提高纯化效果。
同时，还需要注意避免温度和pH值对目标蛋白的稳定性产生不利影响。
洗脱缓冲液的选择也是亲和层析纯化蛋白时需要注意的地方。
洗脱缓冲液的选择应根据亲和基团与目标蛋白的结合力以及目标蛋白与非特异性结合物的结合力来确定。
通常，使用一系列浓度递增的洗脱缓冲液可以有效地去除非特异性结合物，提高纯化效果。
但是，洗脱缓冲液的浓度也不能太高，否则可能会影响到目标蛋白的活性和稳定性。
对于亲和层析纯化蛋白的结果评价也是需要注意的。
在纯化过程中，可以通过检测目标蛋白的纯度、活性以及其他相关特性来评价纯化效果。
同时，还需要对纯化后的目标蛋白进行保存和储存，以保证其在后续实验中的可用性和稳定性。
亲和层析纯化蛋白是一种常用的蛋白纯化方法，但在实验过程中需要注意一些细节。
包括选择合适的亲和层析柱、样品的预处理、温度和pH值的控制、洗脱缓冲液的选择以及结果的评价等。
生物制药工艺学中亲和层析
亲和层析配基的性质与选择
配基的偶联:
1： 酸酐法 2： 羟基琥珀酰亚胺法 3：叠氮化作用 4：还原性烷基化合物（西夫碱）的形成
第二节:载体、配基、目的物的连接： (Conjunction of vector、ligand and target material)
载体（Vectors or Matrix) +
性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3. 洗脱（Elution）
选择适当的条件，将吸附在亲和介质
上的目的物解吸下来（见下图）。
Fig5 . Principle of preparing AC media
第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（ Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择
2： 配基（ligand） ：被固定在基质上的分
子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及
mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。
ge亲和层析原理和方法
ge亲和层析原理和方法引言ge亲和层析（GE Affinity Chromatography）是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于蛋白质纯化和分析等领域。
本文将介绍ge亲和层析的原理和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。
一、ge亲和层析原理ge亲和层析原理基于生物分子之间的特异性相互作用，利用目标分子与特定配体之间的亲和力实现分离。
亲和层析的核心在于选择合适的配体，使其与目标分子具有高度的亲和力。
常用的配体包括抗体、金属离子、亲和标签等。
二、ge亲和层析方法1. 列层析法列层析法是ge亲和层析的常用方法之一。
将配体固定在层析柱上，将混合物（包括目标分子和其他杂质）加入柱上，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法操作简单、适用于大规模制备。
2. 批次层析法批次层析法是ge亲和层析的另一种常用方法。
将配体固定在固相材料上，将混合物与固相材料混合搅拌，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法适用于小规模制备和快速分离。
三、ge亲和层析的应用1. 蛋白质纯化ge亲和层析广泛应用于蛋白质的纯化。
通过选择合适的配体，可以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化，提高纯化效率和纯度。
2. 抗体结合分析ge亲和层析可用于抗体结合分析，通过配体选择性地捕获目标抗体，实现对抗体结合特性的研究。
这对于药物研发和免疫学研究具有重要意义。
3. 蛋白质相互作用研究ge亲和层析还可用于研究蛋白质的相互作用。
通过将不同的配体固定在柱上，可以捕获目标蛋白质的结合伴侣，进一步揭示蛋白质相互作用网络。
4. 基因工程和生物药物制备ge亲和层析在基因工程和生物药物制备中有广泛应用。
通过选择合适的配体，可以实现对表达蛋白质的纯化和分离，提高生物药物的纯度和质量。
结论ge亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，通过选择合适的配体和方法，可以实现对目标分子的高效分离和纯化。
它在蛋白质纯化、抗体结合分析、蛋白质相互作用研究以及基因工程和生物药物制备等领域具有广泛的应用前景。
亲和层析洗杂
亲和层析洗杂
"亲和层析洗"通常是指亲和层析法（Affinity Chromatography）的操作步骤之一。
这是一种用于分离和纯化生物分子的技术，利用其与特定配体之间的亲和力进行分离。
以下是亲和层析洗的内容：
1. 亲和层析填料准备：在柱子中填充具有特定亲和性的配体。
这个配体可以是抗体、受体、金属离子或其他具有特定亲和力的化合物。
2. 样品处理：样品通常是混合物，包含目标分子和其他成分。
该混合物通过预处理，例如细胞破碎、去除杂质等，以准备进行层析。
3. 样品加载：将经过预处理的样品通过填充了亲和层析柱的装置。
在这一步中，目标分子会与填料中的配体结合形成复合物。
4. 非目标成分洗脱：使用洗脱缓冲液冲洗柱子，以去除与填料无关的非目标成分。
这些成分通常不会与配体结合，所以能够较容易地从柱子中洗脱。
5. 目标分子洗脱：使用特定条件或化合物来洗脱目标分子。
这些条件能够破坏配体与目标分子的结合，使目标分子从柱子中洗脱出来。
6. 纯化和收集：收集洗脱出的目标分子，进行后续的纯化和分析。
亲和层析洗是亲和层析法的一部分，通过利用生物分子之间的特异亲和性，实现目标分子与填料上配体的结合和分离。
这种技术在生物学、生物化学和制药等领域广泛应用于分离和纯化生物大分子。
亲和层析技术
亲和层析技术（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。
此法具有高效、快速、简便等优点。
（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。
在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。
纤维素的非特异性吸附强。
聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。
琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。
琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。
琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。
因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
（三）试剂与配制1．Sepharose 4B2．CNBr（剧毒）3．抗原或抗体4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5．0.1Mol/L NaHCO36．2Mol/L NaOH7．0.01Mol/L pH7.4 PBS0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml0.2Mol/L Na2HPO4 162.0mlNaCl 32.76g加水至4 000ml。
第5章亲和层析
第5章亲和层析第5章亲和层析一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。
②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。
③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。
二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。
1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。
②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。
③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。
2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。
3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。
三、亲和层析介质的制备：1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。
②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。
③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。
④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。
常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。
2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。
②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。
③机械性能良好，在一定静水压下不变形。
④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。
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❖8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
❖9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可6M），尿 素（最高可8M）
❖ 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween， NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去 除核酸污染；
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1
亲和层析技术概述
2
亲和层析基本过程
3
His-tag亲和层析常见问题
4
Tips
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亲和层析技术概述
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❖What is Affinity Chromatography?
▪ 亲和层析是利用生物体中多数大分子物质具 有与某些相应的分子专一性可逆结合的特 性而建立的分离纯化技术
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基本概念
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❖亲和作用：生物物质具有识别特定物质并 与该物质分子结合的能力，且可以区分结 构与性质相似的其他分子，这种特异性的 相互作用称为亲和作用。
❖配基:亲和层析中能被某一生物大分子识别 和可逆结合的生物专一性物质。
❖配体：与配基是相对的概念。
失；
❖5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比 如0.1-1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解；
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❖6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏 水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）
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Tips
一些从实验手册里总结出来的Tips ❖1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：
NH4+，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等； ❖2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，
EGTA，等等； ❖3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原，比如
DTT，防止二价Ni被还原； ❖4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流
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❖配基应具备的特性： ❖1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 ❖2.必须具备能被修饰的功能基团
常见配基-配体物质对：酶-底物 酶-抑制物 激素-受体 抗原-抗体 金属离子-氨基酸残基
cDNA-对应的基因片段，等
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常见问题
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1 纯化的组分中没有 His标签的蛋白?
2
层析柱堵塞？
3
样品黏度太大？
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❖解决办法：继续超声破碎，直至黏度降 低
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亲和层析发展史
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1910
1955
1967
用淀粉装柱 来分离淀粉 酶——第一 次认识到亲 和层析
聚苯乙烯载 体连接上抗 原，分离血 液中相应的 抗体
琼脂糖载体取代聚苯 乙烯载体，使亲和层 析得到高速发展，成 为“第二大类”分离 纯化手段，应用广泛 ，亲和对众多。
L6thoGgrouop
亲和层析纯化技术要点
小组成员:徐鹏，蒋美玲，季成，滕嘉琳， 金爽，任沛
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❖生物制药工艺上主要运用的几种色谱技术
吸附色谱
离子交换色谱
分配色谱 凝胶色谱
亲和色谱
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Affinity Chromatography
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金属离子螯合亲和层析
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❖金属离子螯合亲和层析是利用金属离子的 络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分 离系统。
Ni Sepharose 6 Fast Flow
❖含His-tag的rhEGF： His的咪唑基可以与 Ni2+特异性结合。
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亲和层析的特点
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高度特异性
高效能 操作简便
亲和层析
快速 亲和力缓和
应用广泛
通用性差，洗脱不缓和
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亲和层析基本过程
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配基固定化 (Immobilise)
基质Matrix(载体):亲和层析中与配基共价结 合,使其固相化的物质。
因此欲高效分离纯化存在于相当大体积的组织匀 浆或发酵液中的极少量目标产物，同时又混有大 量理化性质相仿的其它生物活性物质时，仅根据 理化性质不同设计分离纯化工艺已远不能满足生 物技术发展的需要。这时就必须从生物亲和作用 力的角度进行研究，而亲和技术正是在此背景下 产生的。
策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合 金属离子。
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二、His标签蛋白与Ni2+结合了，没有被洗脱下来
❖ 可能原因：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上， 结合力较强） 策略：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
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一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了
❖ 可能原因1：超声的功率不对(太大，蛋白炭化， 太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶
❖ 可能原因2：样品或者是结合缓冲液不正确 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确 保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓 度不是太高。
❖ 可能原因：蛋白已沉淀在柱上 策略：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋 白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件(去折叠)下 洗脱(用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍)。
❖ 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应 策略：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的浓度。
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吸附 (Adsorption)
洗脱 (Elution )
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平衡 equilibration
上样 Sample applic.
洗涤 wash
洗脱 elution
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层析柱堵塞
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❖可能原因：细胞碎片
❖解决方案：离心或者用0.22μm的滤膜过滤 发酵液
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样品黏度太大？
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❖可能原因：宿主细胞的核酸含量太高
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一、His标签蛋白没有结合上，都流穿了
❖ 可能原因3：组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用4－8 M 脲，或4－6 M盐 酸胍)进行纯化。
❖ 可能原因4：His标签丢失 策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达， 上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or Nterminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。 策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的 时间。
▪ 其专一性是由分子有关作用基团（官能团） 的化学结构与它们的空间排列决定的
▪ 亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生 物太分子最重要的方法之一
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Background
生物大分子自身的特殊性和复杂性：热稳定性差， 对环境的pH值、有机溶剂、某些无机载体和金属 离子很敏感。
特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗脱 和配基专一作用的蛋白质，不洗脱由于非专一 吸附上去的杂蛋白
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亲和层析的基本类型
❖生物亲和层析 ❖免疫亲和层析 ❖金属离子螯合亲和层析 ❖染料亲和层析 ❖拟生物亲和层析www.themegaller 6thLGorogupo
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洗脱方法
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非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、 介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、洗脱 后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅速恢复到 天然结构