亲和分离技术
1简述亲和色谱分离技术的基本原理
1简述亲和色谱分离技术的基本原理？
答：亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。
亲和色谱的固定相是键和亲和配基的亲和吸附介质。
由于目标产物基于生物亲和作用吸附在固定相上，具有高度选择性，因此，亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端方法。
一般亲和色谱分离操作过程分： 1进料 2杂志清洗 3目标产物脱洗 4色谱柱再生。
2、举例简述亲和色谱分离蛋白的流程？
因为：三嗪类色素配基的特点是化学稳定性高，价格便宜，适应性广，亲和力适中，蛋白质结合容量大，因此，色素亲和色谱的操作成本低廉，有很高的实用价值。
答：以色素亲和色谱纯化脱氢酶为例：
1 加入3L菌体细胞抽提液；
2 用低溶度盐溶液A清洗，除去未被吸附的杂蛋白；
3 逐次到溶度盐溶液B和辅酶I溶液C洗脱，分别获得了羟基酪酸脱氢酶（3-HDH）和苹果酸脱氢酶（MHM）活性峰；
4 收集的3-HDH活性部分超滤浓缩至200ml后透析脱盐；
5 加入到另一个色素亲和柱，继续进行纯化；
6 经过两步色素亲和色谱纯化，3-HDH比活提高213倍（第一步34.4倍，第二部6.2倍）最终收率为78%。
A---10mmol/L磷酸盐缓冲液，PH=7.5(5L)
B----A液+1.0mmol/LKCl，PH=7.5(5L)
C----B液+2mmol/L NADH, PH=7.5(3L)。
第五章 亲和层析分离技术
遮盖，反而使亲和柱吸附力降低。
• 配体浓度太高又会使吸附力太强，造成洗脱困难； • 随着配体浓度的增加，非专一性吸附也增加，而专 一性吸附却降低。 • 理想的配基浓度为1-10µ mol/L；2µ mol/L的凝胶为
最好。
（三）配体偶联的位置
• 在一般情况下，亲和结 合时配体分子与待分离 物质仅有一部分发生相 互作用。 • 为了保证亲和吸附剂有 足够大的亲和能力，我 们希望配体固定化时， 其不参与亲和结合的部 位与载体进行偶联。
抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应
条件。 • 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性 吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。 • 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass的商品都已 事先连接了氨烷基(烷基胺)。 • 用葡聚糖包被玻璃珠则可改善其亲水性，并增加化学活性基 团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在 DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。
二、间隔臂分子（手臂）
• 空间位阻效应 ：待分离生物大分子由于受到基质的空间
障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体。
• 解决的办法是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔 壁”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的
骨架向外扩展伸长。
O gel O OH C
NH + NH2(CH2)nNH2
配体Ligand: 亲和层析中能被某一生物大分
子识别和可逆结合的生物专一性物质。即
被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体): 亲和层析中与配体共价
结合,使其固相化的物质。
亲和吸附剂：配体和基质是共价结合的，
构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
现代分离技术-亲和层析
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七、亲和层析的应用
1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质
结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理
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酶与底物 (包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子)，抗原与抗体，激素与受体，核酸中的 互补链多糖与蛋白复合体。
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对载体的要求
不溶于水，但高度亲水； 惰性物质，非特异性吸附少； 具有相当量的化学基团可供活化； 理化性质稳定； 机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定
的流速； 通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子
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优缺点
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱 过程简单、快速，是一种理想的有效分离 纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高 选择性高活性回收率和高纯度等特点。
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但是亲和层析技术也有一些缺点主要是载 体 (如琼脂糖Sepharose) 价格昂贵机械强 度低 (易压床)配基的制备困难偶联条件激 烈需要使用剧毒的活化剂 (如CNBr)等。
抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和 力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来 说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间。
配体必须有一个适当的化学基团，这个基团不 参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接 支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分 子结合的亲和性。
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适用范围
生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、 抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及 多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等) 的分离和纯化
现代分离技术 -----亲和层析
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概念
亲和膜分离
亲和膜分离08生物工程（2）班0802012008 盛蕾摘要：随着生物工程和生命科学的迅速发展，其对生物大分子纯化的要求越来越苛刻，为获得高纯度、高质量、低成本的产物的产品，亲和膜分离技术出现了。
本文主要介绍了亲和膜的概念、分离原理、制备和亲和膜的应用及展望。
关键词：亲和膜；分离原理；制备；应用1 亲和膜分离概念1.1膜分离技术膜分离技术是用半透膜作为选择障层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，从而达到分离目的的技术。
它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能量等优点，已作为一种单元操作日益受到人们极大重视。
1.2亲和分离技术亲和层析是将欲分离物质的亲和配基通过一“手臂”连接于亲水性珠状载体上装于层析柱，溶液中只有能与配基结合的目标产物被吸附，而所有其他操作则直接流出，用适当的洗脱剂洗脱，使配基与目标产物的复合物解离而释放出目标产物。
亲和层析优点在于简单、快速、特异性强、回收率和纯化倍数高。
1.3亲和膜分离技术亲和膜分离技术是将膜分离和层析技术的结合起来的一项技术，有两者结合的亲和膜分离技术，可发挥两者的特色，具有处理量大、选择性强、易于放大等显著优点。
2 亲和膜分离原理亲和膜是亲和层析及膜分离的结合，亲和膜过程所采用的设备和膜分离所用的类似，也是在膜组件如中空纤维组件、平板式组件中进行，而其操作过程又类似于亲和层析：将样品混合物缓缓地流过膜，使其中与亲和配基有特异性相互作用的分子与配基产生偶合，生成相应的配合物，然后再通过改变条件，如洗涤液组成、pH、离子强度、温度等，使已和配基产生相互作用的配合物分子解离，将其收集起来，再将膜进行洗涤，再生成平衡，以备下次使用。
3亲和膜制备3.1膜材料的选择要实现在膜上的亲和分离，要解决一下几个关键问题：①膜表面要有足够多可利用的化学基团，使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基；②要有足够高的表面积，以便获得足够数量可利用的基团，并有足够大的孔径，以便能让生物大分子自由出入；③孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能；④在许多情况下，为了实现快速分离，一般要加压操作，因此要求膜要有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形；⑤亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度盐的缓冲液和有机溶剂。
亲和层析分离原理
亲和层析分离原理嗨，朋友们！今天咱们来聊聊一个超有趣的东西——亲和层析分离原理。
这可不是什么枯燥的科学术语，听我慢慢道来，保准你会觉得像听故事一样好玩。
想象一下，你在一个超级大的聚会里，人来人往，形形色色。
这里面呢，有一些人是特别要好的朋友，他们之间就像磁铁一样，一见面就紧紧吸引在一起。
亲和层析就有点像这个聚会里找好朋友的过程。
亲和层析里有个关键的东西叫亲和层析介质。
这就好比是聚会的场地，它可是很有讲究的。
这个介质就像是一个个有特殊功能的小房间，每个小房间都有自己独特的“性格”或者说特性。
比如说，有些小房间对某种特定的蛋白质特别有吸引力，就像有些场地专门是为某类人群举办活动的。
那我们要分离的东西呢，就像那些来参加聚会的人。
比如说我们要分离一种特殊的酶。
这种酶就像是一个有特殊身份标识的客人。
在亲和层析这个“大聚会”里，我们的酶客人有着它独特的标签，就像它穿着一件独一无二的衣服。
而我们的亲和层析介质小房间里呢，有和这个标签完美匹配的“挂钩”。
这就好比是，酶客人的衣服上有个特制的纽扣，而小房间里有个刚好能扣上这个纽扣的扣环。
我给你讲个我和我朋友小李做实验的事儿吧。
我们当时就想分离一种特定的蛋白质。
我们准备好了亲和层析的装置，就像精心布置好了聚会场地一样。
当我们把含有各种蛋白质的混合液倒进去的时候，就像是一群人涌入了聚会场地。
那些和我们目标蛋白质不一样的家伙呢，就像是在场地里随便逛逛的路人，他们在介质小房间里没有什么特别的吸引力，就继续随着液体流动，流到别的地方去了。
但是我们的目标蛋白质啊，一看到那个有着匹配“挂钩”的小房间，就像失散多年的朋友重逢一样，一下子就紧紧地结合在上面了。
这时候，我们就可以把那些还在流动的、不需要的蛋白质都冲走，就像把那些闲逛的路人请出场地一样。
然后呢，我们怎么把我们紧紧结合在小房间里的目标蛋白质拿下来呢？这就像是要把紧紧抱在一起的好朋友分开，有点难，但也有办法。
我们可以改变一些条件，比如说改变溶液的酸碱度或者盐浓度之类的。
亲和色谱模拟分离过程
亲和色谱，也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。
该方法依赖于键合在固定相上的配体与生物活性目标分子间的特异性识别与可逆的亲和力作用，实现生物分子选择性分离。
在实际操作过程中，首先将待分离的物质连接到凝胶过滤色谱柱上，并确保连接的分子与待分离物质有一定的结合能力，这种结合是可逆的，即在改变流动相条件时可以相互分离。
然后通过调整流动相条件使得待分离物质与基质之间的相互作用增强或减弱，从而实现分离。
亲和色谱法具有高分辨率、高选择性的特点，因此被广泛应用于复杂样品的分离纯化过程。
例如，可以利用亲和色谱法从混合物中纯化或浓缩某一特定分子，也可以用于去除或降低混合物中特定分子的含量。
此外，亲和色谱还可以用于从变性或功能不同的版本中分离活性生物分子，以及从大量粗样品中分离低浓度的纯化合物。
亲和层析分离蛋白的原理
亲和层析分离蛋白的原理1. 亲和层析的概念在我们谈论亲和层析之前，得先知道这个名字是个什么玩意儿。
亲和层析，听起来有点高大上，但实际上就是一种把蛋白质分离开来的妙招。
简单说，就是利用蛋白质和特定配体之间的“有缘千里来相会”，通过这种“亲和力”把目标蛋白分离出来。
想象一下，你在一场派对上找朋友，结果发现你们两人之间有个共同的爱好——这就是亲和层析的精髓！1.1 亲和层析的基本原理这玩意儿主要靠两种东西，一个是“固定相”，另一个是“流动相”。
固定相就像是派对上的那个角落，只有你喜欢的朋友才能待在那儿。
而流动相则是所有的杂乱无章的人群。
通过流动相把混合物送到固定相上，只有跟固定相“有缘”的蛋白才能被留住，其余的就随风而去了。
想象一下，经过亲和层析的洗礼后，留下的都是你最喜欢的朋友，真是乐在其中！1.2 亲和层析的步骤让我们一步一步来，亲和层析的过程其实也没那么复杂。
第一步，你得准备好你的“聚会场地”，也就是固定相。
这个固定相上会有一些特定的配体，专门用来“勾搭”你想要的蛋白。
然后，把混合物通过流动相慢慢注入，哇哦，杂乱的蛋白质们开始游走。
接着，那些与你的配体有好感的蛋白就开始在固定相上“扎根”了，没错，就是这么简单！最后一步，利用一些洗脱液，把留在那儿的蛋白质洗出来，你就成功分离出目标蛋白啦，真是大功告成，热烈掌声！2. 亲和层析的优势说到亲和层析的优势，那可真是数不胜数。
首先，它的特异性极强，就好比一把钥匙只能开一把锁，能精准地找到目标蛋白，省时省力，简直是“事半功倍”。
其次，操作也非常简单，甚至让那些实验室的小白都能轻松上手。
对比其他复杂的分离技术，亲和层析简直就像在逛超市，轻松自在。
2.1 适用范围亲和层析的适用范围也非常广泛哦。
从生物制药到基础研究，各种蛋白质的分离都能派上用场。
比如，分离酶、抗体，甚至是一些特殊的转运蛋白，这一切都能轻松搞定。
就好像你去餐馆吃饭，点的菜式多得是，总有一款适合你！2.2 亲和层析的局限性不过呢，亲和层析也不是完美无瑕的，它也有一些局限性。
ge亲和层析原理和方法
ge亲和层析原理和方法引言ge亲和层析（GE Affinity Chromatography）是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于蛋白质纯化和分析等领域。
本文将介绍ge亲和层析的原理和方法，并探讨其在生物科学研究中的应用。
一、ge亲和层析原理ge亲和层析原理基于生物分子之间的特异性相互作用，利用目标分子与特定配体之间的亲和力实现分离。
亲和层析的核心在于选择合适的配体，使其与目标分子具有高度的亲和力。
常用的配体包括抗体、金属离子、亲和标签等。
二、ge亲和层析方法1. 列层析法列层析法是ge亲和层析的常用方法之一。
将配体固定在层析柱上，将混合物（包括目标分子和其他杂质）加入柱上，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法操作简单、适用于大规模制备。
2. 批次层析法批次层析法是ge亲和层析的另一种常用方法。
将配体固定在固相材料上，将混合物与固相材料混合搅拌，通过洗脱等步骤实现目标分子的分离和纯化。
此方法适用于小规模制备和快速分离。
三、ge亲和层析的应用1. 蛋白质纯化ge亲和层析广泛应用于蛋白质的纯化。
通过选择合适的配体，可以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化，提高纯化效率和纯度。
2. 抗体结合分析ge亲和层析可用于抗体结合分析，通过配体选择性地捕获目标抗体，实现对抗体结合特性的研究。
这对于药物研发和免疫学研究具有重要意义。
3. 蛋白质相互作用研究ge亲和层析还可用于研究蛋白质的相互作用。
通过将不同的配体固定在柱上，可以捕获目标蛋白质的结合伴侣，进一步揭示蛋白质相互作用网络。
4. 基因工程和生物药物制备ge亲和层析在基因工程和生物药物制备中有广泛应用。
通过选择合适的配体，可以实现对表达蛋白质的纯化和分离，提高生物药物的纯度和质量。
结论ge亲和层析是一种重要的生物分离和纯化技术，通过选择合适的配体和方法，可以实现对目标分子的高效分离和纯化。
它在蛋白质纯化、抗体结合分析、蛋白质相互作用研究以及基因工程和生物药物制备等领域具有广泛的应用前景。
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α-2-巨球细胞
S-23 骨髓瘤蛋白 3-氧代类固醇异构酶 胰蛋白酶
Cu2+
二硝基酚 雌甾二醇l 对氨基苯咪
PEG/dextran
PEG/dextran PEG/ dextran PEG/dextran
6.1.2 亲和配基高聚物的合成
亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下 相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体 系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通 过化学方法结合在PEG上。
二次作用亲和沉淀
制备亲和沉淀介质:利用在物理场如pH、离子强度、 温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶 性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质 与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。
特异性结合 目标分子
形成 亲和沉淀
目标分子 解离
亲和沉淀原理图
亲和沉淀的优点
溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻， 亲和结合速度快，结合充分； 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率
目标蛋白质的结合位点不被配基－聚合物饱和时
KC K P 1 (CL kd )1
N
1 (CL
kd ) 2
N
6.1.4 亲和分配的应用
乳酸脱氢酶（LHD）的亲和分配
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶（G6PDH）的纯化
6.1.4 亲和分配的应用
葡萄糖-6-磷酸化脱氢次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation)
一次作用亲和沉淀
水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基， 即双配基(bis-ligand)和多配基(polyligand) 通过与多价蛋白质 (multivalent protein) 支联，在适 当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原－抗体的沉淀作用相 似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率 最高。
第六章
6.1 6.2 6.3 6.4 6.5
亲和分离技术
亲和萃取 亲和沉淀 亲和膜技术 分子印迹分离技术 亲和反胶团萃取技术
6.1 亲和萃取
亲和萃取简介
亲和配基高聚物的合成
亲和分配的影响因素和亲和模型 亲和分配的应用
6.1.1 亲和萃取简介
萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离 技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。 亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分 离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。
主要包括以下两种:
PEG 的活化 亲和配基直接反应
6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型
影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如 PEG浓度，还有: 配基浓度 配基载体 染料配基 pH: 增加，效率降低 温度: 升高，效率降低 盐浓度
亲和分配的影响因素和亲和模型
盐对分配系数的影响 盐的种类
88
81 89 33 21 —— —— 1 ——
临苯二甲酸钾
NaClO4
——
——
48
42
——
——
亲和分配的影响因素和亲和模型
体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时
亲和分配的影响因素和亲和模型
整个过程的自由能变可以列成如下算式
ΔG5＝ΔG1＋ΔG2＋ΔG3＋ΔG1
G1 RT ln(kd )1
G4 RT ln(k d ) 2
磷酸钠（添加）
添加盐时的△log K占不添加盐时的百分数（％） 25mM 100 63mM 103 250mM ——
甲酸钠，pH7
醋酸钠，pH7 丙酸钠，pH7 Na2SO4 KCl Li2SO4 Tris，pH7 KI NaSCN
——
105 —— 98 104 —— —— 97 ——
——
97 —— 85 80 77 76 69 67
亲和萃取简介
常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质 分离蛋白
白蛋白 碱性磷酸化酶 共脂肪酶（Colipase） 脱氢酶，激酶
亲和配基
脂肪酸 Procion red HE-3G 卵磷脂Lecithin 活性染料
体系 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐 PEG/dextran PEG/dextran, PEG/ 盐
G2 RT ln K L
G3 RT ln K p
G5 RT ln K c
亲和分配的影响因素和亲和模型
推导得
K c (k d ) 2 K L (k d )1 K P
有N个结合位点的蛋白质而言
KC (kd ) 2 K L (kd )1 K P
N
log K max log(K C K P ) N log K L
一次作用亲和沉淀
一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别 是4价以上的蛋白质 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分 离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用 上存在较大难度。 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配 基自交联(ligandself-assoliation)的现象，成为交 联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所 以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。
6.2 亲和沉淀分离技术
亲和沉淀的原理
亲和沉淀聚合物和亲和配基
亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基 亲和沉淀的展望
6.2.1 亲和沉淀的原理
亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性 识别与沉淀分离相结合的纯化技术。 亲和沉淀的机理：
配体的连接
加到含有目标 分子得溶液中