细胞凋亡检测
细胞凋亡与检测原理
细胞凋亡与检测原理细胞凋亡（apoptosis）是一种由体内分子机制调控的程序性死亡过程。
细胞凋亡对于维持身体健康和发展正常的组织功能至关重要。
它在多种生理和病理过程中发挥重要作用，包括胚胎发育、免疫监视和应答、细胞数量调节、损伤修复和肿瘤的发展等。
因此，对细胞凋亡的检测与研究对于了解细胞凋亡的机制和应用于治疗疾病具有重要意义。
细胞凋亡的检测可以通过多种方法和实验手段进行，下面将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法及其原理。
1.形态学检测法：细胞凋亡在形态上表现为细胞体积的缩小、细胞核染色质的凝结、细胞核的畸变和断裂等特征。
这些特征可以通过光学显微镜观察到。
常用的形态学检测方法有苏木精-伊红染色、核小体染色和电镜观察等。
2.核酸染色检测法：细胞凋亡过程中，细胞核内的DNA分子发生明显的断裂和畸变，这可以通过核酸染色荧光探针来检测。
常用的核酸染色方法有荧光染料染色、DNA单断链检测和TUNEL（转移酶介导的末端标记化反应）法等。
TUNEL法是最常用的细胞凋亡检测方法之一，它通过用荧光标记亲和剂连接到DNA断裂末端的3'-OH基团来检测细胞凋亡的程度。
3. 蛋白质检测法：细胞凋亡过程中，许多蛋白质的表达水平会发生明显变化。
比如，细胞凋亡会导致Bax、Caspase家族蛋白的活化和表达增加，而抑制凋亡的蛋白质Bcl-2则会下调。
因此，通过Western blot 和免疫组化等方法，可以检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平的变化。
4.流式细胞术：流式细胞术是一种通过光电探测器测定细胞数量和特征的方法。
流式细胞术可以通过筛选和排序上述染色体和蛋白质等特征，来确定细胞凋亡发生的程度和类型。
比如，通过测定细胞的细胞质内的卵磷脂翻转（PS）外露与细胞核DNA染色剂（如PI）结合的比例，可以鉴定凋亡细胞和坏死细胞。
细胞凋亡的检测原理是基于细胞凋亡的特征改变。
比如，形态学检测法通过观察细胞的形态学变化来鉴定细胞凋亡；核酸染色检测方法通过检测DNA断裂和畸变来判断细胞凋亡；蛋白质检测法则通过检测细胞凋亡相关蛋白质的表达水平变化来鉴定细胞凋亡。
细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的检测方法细胞凋亡是一种程序性死亡方式，它在维持机体内稳态、发育、组织修复和免疫调节等方面起着重要作用。
因此，对细胞凋亡的检测方法进行研究和探索具有重要意义。
目前，常用的细胞凋亡检测方法主要包括形态学观察、DNA断裂检测、蛋白质检测和细胞功能检测等多个方面。
下面将对这些方法进行详细介绍。
首先，形态学观察是最为直观的细胞凋亡检测方法之一。
在细胞凋亡过程中，细胞会出现形态学上的变化，如细胞体积减小、细胞浆浓缩、细胞膜破裂等。
这些变化可以通过显微镜观察细胞形态的改变来进行检测。
其次，DNA断裂检测也是常用的细胞凋亡检测方法之一。
在细胞凋亡过程中，细胞的DNA会发生断裂，形成典型的“DNA ladder”图谱。
通过凝胶电泳等技术可以检测出这种特征性的DNA断裂，从而判断细胞是否发生凋亡。
另外，蛋白质检测也是细胞凋亡检测的重要手段之一。
在细胞凋亡过程中，一些特定的蛋白质会发生变化，如Bcl-2家族蛋白、caspase蛋白等。
通过Westernblot等技术可以检测这些蛋白质的表达水平，从而判断细胞是否发生凋亡。
最后，细胞功能检测是细胞凋亡检测的另一重要方法。
在细胞凋亡过程中，细胞的功能会发生改变，如线粒体功能的丧失、细胞色素C的释放等。
通过检测这些细胞功能的改变可以判断细胞是否发生凋亡。
综上所述，细胞凋亡的检测方法主要包括形态学观察、DNA断裂检测、蛋白质检测和细胞功能检测等多个方面。
这些方法各具特点，可以相互印证，从而准确判断细胞是否发生凋亡。
在实际研究中，可以根据具体情况选择合适的方法进行检测，以更准确地了解细胞凋亡的发生和机制。
希望本文对细胞凋亡的检测方法有所帮助。
细胞凋亡常用检测方法
细胞凋亡常用检测方法
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1. 哎呀呀，流式细胞术检测法你可不能错过呀！就好比在细胞的世界里，它像是一个超级侦探，能快速又准确地发现哪些细胞在凋亡呢！比如说，在研究一些疾病时，它就能帮我们搞清楚细胞的状态变化，神奇吧！
2. 嘿，还有形态学观察法哟！这就像是用一双敏锐的眼睛直接去看细胞凋亡后的模样变化，像那些凋亡小体啥的，都能被发现，就像在细胞的世界里寻找独特的线索一样，是不是很有意思呀！
3. 哇塞，DNA 片段化检测也超重要的呀！这就好像是去拆解细胞凋亡留下
的特殊“密码”，通过检测那些断裂的 DNA 片段，就能知道细胞是不是走上凋亡之路了。
比如在检测肿瘤细胞的时候，这可派上大用场啦！
4. 听我说呀，检测蛋白表达情况也是个好办法呢！就像是给细胞身上的蛋白做个标记，一旦细胞凋亡，这些蛋白就会有不一样的表现，这不就容易发现啦？好比在研究细胞的生命轨迹时，这能提供关键信息哟！
5. 哈哈，TUNEL 法也很厉害呢！它就如同给凋亡的细胞打上一个独特的“印章”，让它们无处可藏。
想象一下，在复杂的细胞群体中，一下子就能把凋亡的那些给找出来，多牛呀！
6. 哎哟哟，Annexin V 法也不能不提呀！它简直就是抓住细胞凋亡早期信号的高手，就像在细胞刚刚开始变化时就一把抓住，能及时发现呢！比如在研究某些药物对细胞的作用时，它就能大显身手啦！
总之，这些细胞凋亡常用检测方法都各有各的奇妙之处，它们可是我们探索细胞世界的得力工具呀！。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，希望能为相关研究提供一些参考。
首先，细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。
因此，通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。
在实验中，可以使用荧光染料（如荧光素酶、荧光素酶底物等）标记细胞核和细胞膜，然后观察细胞形态的改变。
这种方法简单直观，但不够精确，需要结合其他方法进行验证。
其次，细胞凋亡过程中，细胞内的DNA发生断裂和片段化，产生特征性的DNA ladder。
因此，DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以通过DNA提取、电泳等技术，检测细胞内DNA的片段化情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确，但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。
另外，细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂会外翻，暴露磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面。
因此，PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS，然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏，但需要较为昂贵的试剂和设备。
最后，细胞凋亡过程中，细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变，如半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化。
因此，caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用荧光染料标记caspase活性底物，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。
这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性，但需要较为复杂的实验操作和数据分析。
综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，各有优缺点。
在实际研究中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。
希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助，推动细胞凋亡机制的深入研究，为疾病的防治提供新的思路和方法。
tunel法检测细胞凋亡实验步骤
tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。
其中一种常用的方法是使用tunel法。
本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。
实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。
将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。
在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。
例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。
2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。
常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。
将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。
3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。
洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。
4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。
将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。
一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。
5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。
tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。
按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。
反应时间一般为1-2小时。
6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。
然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。
将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。
7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。
可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。
【最新】凋亡细胞检测方法
【最新】凋亡细胞检测方法
众所周知细胞的凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞，在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面我们来介绍以下几种我们常用的测定方法。
（一）细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞的一种固有的形态特征，人们已经设计许许多多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1光学显微镜和倒置显微镜
（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
3透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、
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边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
应广大用户的强烈要求，中国科学院生物化学与细胞生物学苏州研究院可提供细胞凋亡检测服务。
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检测细胞凋亡的三种流式方法
检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。
其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。
下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。
1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。
当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。
Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。
通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。
2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。
通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。
这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。
由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。
总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
细胞凋亡的六种检查方法
细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。
因此，对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。
本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。
二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。
它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端，并通过荧光或酶标记来检测。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 用缓冲液进行处理，使得DNA断裂末端暴露出来；3. 加入TdT和dUTP标记物，使得dUTP与DNA断裂末端连接；4. 洗涤样品，并加入抗dUTP抗体标记物；5. 洗涤样品，并观察荧光或颜色变化。
三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。
它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化，通过Annexin V结合检测细胞凋亡。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Annexin V标记物，使得其与PIP2结合；3. 加入PI染色剂，使得细胞核染色；4. 观察荧光或颜色变化。
四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Caspase底物和缓冲液，使得Caspase底物被水解；3. 观察荧光或颜色变化。
五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并提取其中的DNA；2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并观察条带形态。
六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化，从而判断凋亡的程度。
操作步骤如下：1. 取出样品，并进行适当处理；2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。
七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法，每种方法都有其特点和优缺点。
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。
样品应保持新鲜和完整。
2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。
3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。
悬液中细胞应保持单细胞状态。
4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。
常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。
5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。
6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。
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细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验
细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验
1、四氮唑盐（MTT）比色法
• 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT 黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积 于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能 溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪， 在490，570 nm波长处测定其光吸收值（OD）， 可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内， MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 • 此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞 毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测 定等。
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
不同凋亡阶段的区分
PI＋Annexin－V细胞凋亡检测
DNA 含 量 -PI
Annexin-V
PI Fluorescence
Annexin V-FITC Fluorescence
Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium
chromatin condensation and fragmentation
（五）、 细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡的形态学检测 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 线粒体膜势能（mt）的检测 DNA片断化检测 TUNEL法 Caspase-3活性的检测 WB检测 凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析
• 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细 胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻 转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性 磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将 Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记， 以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细 胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测 细胞凋亡的发生。
Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI
3.线粒体膜势能（△）的检测
线粒体荧光染料： Rhodamine 123、DiOC6（3）、 JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光 的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
（三）、凋亡与坏死
Normal
Apoptosis
Necrosis
凋亡与坏死主要鉴别（形态学）
凋 细胞形态 过 程 细胞器 亡 坏 死 细胞膜出芽，冒泡但完整性 好，活组 织中个别细胞死亡 固缩核，浓染胞浆，脱离。凋亡小体 细胞器未遭破坏，胞浆浓缩 细胞完整性破坏 成片细胞死亡，破坏组织结构 细胞肿胀，核淡染，凝固性坏死， 无膜性小体 细胞器肿胀溶解
一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
电子显微镜观察
光学显微镜观察
Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process （488nm 400）
4、细胞DNA合成的3H-TdR 掺入实验
原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的 碱基，也是DNA合成的必需物质。用核苷3H标 记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入 DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强 度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。
五、细胞凋亡检测方法
（一）、凋亡概念：
Apoptosis Assays
1.细胞凋亡的形态学检测
光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质 浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
2、细胞蛋白质含量测定法 （考马斯亮蓝测定法）
• 原理：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合后，在 595nm波长处呈现最大吸收量，其吸光值与蛋白质 含量呈正相关。 • 此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异 性活性的度量单位。
3、细胞蛋白质 合成的3H-亮氨酸掺入实验
原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨 基酸，用核素标记氨基酸，如3H-亮氨酸，可以 掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的 放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。
NIH 3T3 mouse fibroblasts exposure to hydrogen peroxide
线粒体膜势能（ △ ）的检测
Healthy cell
apoptotic cells
4.DNA片段化分析
细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180200bp整数倍的寡核苷酸 片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。
细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动 死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由 基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即 是由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡 过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。
（二）、凋亡的研究历史
a、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972） 1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡 （programmed cell death ）概念。 1971年 澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。 1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概 念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。 b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987） c、蛋白质水解酶活化的研究(1995) d、细胞膜的变化(1997) e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-) 1) 相关基因及调控 2）信号转导 3）各种分子及其相互作用及相互关系 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。 Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7.
the other envisions opening of channels in the outer membrane thus releasing cyto c from the intermembr ane space of mitochondri a into the cytosol.
Multiple apoptotic pathways emanate from the mitochondria.
Trypan blue staining of adult rat cardiac myocytes in primary culture. Live cells exclude the blue dye, and so appear clear. Dead cells take up the dye and appear blue.
3、细胞分裂指数
• 细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指 标；以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计 算。 • 方法：染色后血细胞计数板计数
细胞分裂指数＝细胞分裂相数/细胞总数（1000）×100％
4、克隆形成率
• 克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的 细胞，反映细胞群体依赖性和增殖能力。
结果分析
• 细胞密度
细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/ 4 ）×104×稀释倍数
• 细胞存活百分率
细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％
2、细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标， 是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲 线分析细胞增殖 • 方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的 同一代细胞，经培养后每隔24 h取出几瓶细胞进 行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞 数为纵坐标，即为该细胞的生长曲线。 • 方法二：四氮唑盐（MTT）比色法
不引起炎症反应，迅速退 化，无整个 引起炎症反应，继发性组织损伤， 组织瓦解，不诱发组织的再生与修复， 诱发组织再生与修复，形成疤痕， 细胞生长增殖→凋亡 坏死→补偿性增生→细胞增殖
（四）、细胞凋亡的过程及机理
接受凋亡信号
凋亡调控分子间的相互作用
蛋白水解酶（caspases）的活化 凋亡的级联反应
• 各种细胞克隆形成率差别很大，一般初代细胞克隆 形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率 弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤 细胞强。
• 方法
克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％
• 注意：细胞要分散好，不能有细胞团，接种密度不 要过大。
四、细胞生物活性的化学检测法
•
•
四氮唑盐（MTT）比色法
5.DNA 末•
细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但 Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不 可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可 逆有限水解底物的级联放大反应过程。 • 半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因 此又称之为Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ， Asp ，proteases的词头)
凋亡主要信号途径
Model for caspase activation by mitochondria.
osmotic disequilibrium leading to an expansion of the matrix space, organellar swelling, and subsequent rupture of the outer membrane