酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性方法的建立
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法一、实验目的掌握抑菌圈法测定杀菌剂的生物活性的方法及步骤。
二、实验原理本实验主要采用抑菌圈法来测定杀菌剂的生物活性。
抑菌圈法是利用杀菌剂在琼脂平板上产生的抑菌效果来对其生物活性进行测定的一种方法。
通常，将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，使其均匀地分布在琼脂上。
然后，将含有细菌培养物的琼脂平板放入恒温箱中进行培养。
在培养一段时间后，观察平板上是否出现了抑菌圈，并测量抑菌圈的直径来评估杀菌剂的生物活性。
三、实验仪器和材料1.显微镜2.恒温箱3.滴定管或移液管4.琼脂平板5.细菌培养物6.杀菌剂溶液四、实验步骤1.准备琼脂平板。
将琼脂平板置于恒温箱中，加热至溶化状态后取出，待其稍微冷却后均匀地倒入培养皿中。
2.滴加杀菌剂溶液。
将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，并用移液管在平板上转动，使杀菌剂均匀地分布在琼脂上。
3.检验杀菌剂效果。
取一定量的细菌培养物，将其在琼脂平板上均匀涂布。
4.培养细菌。
将含有细菌培养物的琼脂平板放入预先恒温箱中，设置合适的温度和培养时间。
5.观察抑菌圈。
在培养一段时间后，取出琼脂平板，用显微镜观察平板上是否出现了抑菌圈。
6.测量抑菌圈直径。
使用直尺或量角器等工具测量抑菌圈的直径，并记录结果。
五、实验注意事项1.操作时要注意无菌技术，以避免细菌污染。
2.滴加杀菌剂溶液时要均匀并轻柔，以保证杀菌剂能充分分散在琼脂平板上。
3.培养细菌时要控制好温度和培养时间，以确保细菌能够充分生长。
4.观察抑菌圈时要注意使用合适的放大倍数，以免错过细小的抑菌圈。
5.测量抑菌圈直径时要使用准确的测量工具，以获得准确的结果。
六、实验结果处理根据实验所得的抑菌圈直径数据，可以通过计算其平均值、标准差等统计指标来评估杀菌剂的生物活性。
较大的抑菌圈直径通常表示杀菌剂具有较强的抑菌效果，反之则表示其抑菌效果较弱。
可以将实验结果与已有的标准值进行比较，以判断杀菌剂的生物活性。
七、实验结果分析根据测得的抑菌圈直径结果，可以对杀菌剂的生物活性进行分析。
抗菌肽抑菌活性测定方法的研究
抗菌肽或肽类抗生素为生物体内稳定存在或 在 创 伤 感 染 后 诱 导 产 生 的 一 类 活 性 分 子 ［1 ，2 ］ 。 其 分 子 量 较 抗 生 素 大 ，分 子 结 构 复 杂 。 抗 菌 肽 具 有 水 溶 性好，无免疫原 性 ，抗 菌 性 广 谱 等 特 点 ，并 对 肿 瘤 细胞、病毒、真 菌 和 原 虫 等 有 杀 伤 作 用 ，是 一 类 令 致病菌很难产生耐药性的新概念药物
脂 ， 溶解后于 0.1 Mpa 、121℃ 下灭菌 20 min ， 冷却至
再 以 MH 培 养 基 对 其 进 行 稀 释 , 稀 释 度 以 5 μg/mL 为 中 心 进 行 系 列 2 倍 稀 释 ， 终 浓 度 为 160 μg/mL ，
80 μg/mL,40 μg/mL ，20 μg/mL ，10 μg/mL ，5 μg/mL ， 2.5 μg/mL,1.25 μg/mL ，0.625 μg/mL ，0.3125 μg/mL ，
图3
7）注 入 空 气 ： 向 每 组 2 片 叶 中 的 另 一 片 的 塑 料 袋
内 注 入 空 气 ， 向 “ 装 置 ” 注 入 10 mL 水 替 代 NaOH 溶 液 ）； 重 复 实 验 步 骤 6 （ 或 用 注 射 器 吸 取 空 气 直 接 注 入 ）。
图4 光合作用需要二氧化碳的实验
抑菌圈大小及现象
菌株 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌
160 80 40 20 10
+ +
5 2.5 1.25 0.63 0.31 0
40 μL （40 μg/ 纸片 ）。 1.2 1.2.1
方法
18 h 后 观 察 结 果 。 1.2.4
在配制好的
TTC 微 量 稀 释 法
如何检测材料的抗菌防霉性能
如何检测材料的抗菌防霉性能？
抗菌防霉检测是检验抗菌防霉类产品质量是否过关的重要手段。
抗菌防霉检测分为定量检测和定性检测两种。
电器、医用材料、食品、化妆品包装等新材料都有新的抗菌防霉的功能需求，嘉峪检测网已经成功帮助一批生产企业完成了抗菌防霉的实验方案和测试。
下面我们来了解一下测试原理。
1、抗菌产品定量检测
定量检测的原理是将标准菌株定量接种于抗菌产品后，经过一定时间的培养，抗菌产品抑制或杀死标准菌株；而没有经过抗菌处理的对照样品接种标准菌株后，接种菌不会受到抑制或杀死，因此，根据测试菌数量的减少率可以定量评价抗菌效果。
根据检测方法和计算方法的不同，计算结果又可以分为抑菌率和杀菌率（对应杀灭对数值）。
在定量检测法中，根据测试菌液接种到试样上的方式不同，可分为振荡法、吸收法、悬液定量法、载体法等。
定量测试方法包括试样（包含对照样）制备、消毒、接种标准菌株、培养、一定时间后对接种菌进行回收并计数。
定量测试方法的优点是定量、准确、客观，缺点是时间长、费用高。
2、抗菌产品定性检测
定性检测原理是通过将抗菌样品与标准菌株以及琼脂相接触，经过一段时间培养，观察琼脂接触面有无微生物生长，以此来判断样品是否具有抗菌性能。
定性检测的优点是测试时间短、测试费用较低；但该试验不能定量测试抗菌产品抗菌活性的强弱，只能判定产品有无抗菌性能，而且测试重复性及稳定性相对较差。
3、防霉产品定性检测
按标准类型分类。
抗菌活性测试步骤
抗菌活性测试步骤与实验器材第一天中午12点1、准备9个锥形瓶〔1个备用，4个培养菌液，4个稀释菌液〕，洗净，烘干2、先在备用锥形瓶中配制500ML液体培养基，溶解后，倒入其余8个锥形瓶中，每瓶50ML。
盖上半透膜，用绳或皮筋系住，在用报纸盖上一层，用皮筋系住。
液态培养基：蛋白胨5g，酵母2.5g，氯化钠5g，水500ML，按比例增减。
〔半透膜〕第一天下午3点3、将9个锥形瓶，200μL枪头两盒，10μL枪头，1ML枪头，用报纸包住，放入灭菌箱中，灭菌20min。
121摄氏度。
〔灭菌锅〕第一天下午4点4、配药液，按照0.0010g—1ML，0.0020g—2ML，这种浓度配药液配出的浓度为1000μg/mL,溶剂为DMSO：水=1:1.等着全部溶解。
第一天晚上6点5.稀释药液，将配制好的药液浓度为1000，500，250，125μg/mL，四个浓度梯度。
第一天晚上9点6、将超净台打开紫外灯灭菌20min，点燃酒精灯，从灭菌箱取出4个锥形瓶，把接种环放在酒精灯上烧红，冷却几秒，从固体斜面菌落中划出一点，放在培养基中，放入摇床〔转速131，温度37摄氏度〕中培养12个小时。
〔从左到右依次为接种环，超净台，摇床〕第二天早上7点7、将超净台打开紫外灯灭菌20min〔需要灭菌的器材：96孔板，枪，酒精灯；放在超净台上即可〕。
将稀释好的药液加入到96孔板中，每孔加10μL〔用从灭菌器中取出灭过菌的10μL枪头〕，横行12个孔，每种浓度的药液重复加3个孔；竖行8排，8种药。
每种菌要加一排阳性对照：即氯霉素4种浓度，每种浓度重复3个孔，4个浓度，正好横行一排12个孔。
再加一排对照，其中3个孔为溶剂10μL〔无药空白对照〕，另三个孔只加菌液90μL〔阴性对照〕〔96孔板，EP管〕第二天早上9点——到11点8、把摇床中菌液取出〔浑浊即为菌长起来了〕，再把灭菌器中的另外4瓶培养基和1ml的枪头取出，点燃酒精灯，用酒精喷壶，喷下试验台和手，进行灭菌。
梅里埃微生物药敏鉴定分析仪操作规程
梅里埃ATB微生物药敏鉴定分析仪操作规程1 主要技术指标梅里埃ATB微生物鉴定／药敏分析系统融合了自动化、电脑化及微生物微量生化反应测试方法，可同时进行微生物分析鉴定（ID）与药敏（MIC）检测，使细菌鉴定／药敏分析规范化、标准化、现代化。
1.1完善的分析系统：微生物鉴定分析系统，微生物药敏分析系统统计分析／院内感染监测专家系统联网功能1.2药物种类：呋喃类，磺胺类，喹诺酮类，青霉素类大环内酯类，氨基糖甙类，头孢菌素类1.2鉴定范围：肠杆菌科，非发酵菌，葡萄球菌属，真菌，微球菌属，链球菌属，肠球菌属，弧菌属1.3院内感染检测环境空气，物体表面，医疗用品，消毒剂及保存液，血液透析2 适用范围梅里埃ATB微生物分析系统(包括微生物鉴定和药敏分析两大功能)；是对己分离培养出来的细菌、真菌等微生物进行种、属鉴定，并同时测定该菌对各种抗菌药物敏感/耐药程度的专用设备。
3 工作原理自1880年郭霍(Koch)发明固体培养基，对细菌的研究技术有了重大的突破之后，一个多世纪以来，人类对细菌的研究和认识已经得到了极大的成就，对细菌分类的理论根据和方法已趋成熟，命名已经统一，对繁浩的各种细菌众多的生物学、物理学特性己基本明确，从20世纪初开始，形成了利用各种细菌之间生物学、物理学特性的差异或不同，来区别和鉴定细菌种类的方法，不断丰富发展，沿用至今，成为细菌鉴定的常规方法。
但由于细菌种类繁多，生物学性状错综复杂，实验操作繁琐、费时，不仅初学者不易掌握，有经验者也常感困惑。
20世纪70年代，由于电子计算机的发展，有人首先利用信息编码来签定细菌，将复杂的各种细菌的生物学性状建立数据库，被检菌的各种生物性状测出后，输入电脑与贮存信息相比较即刻可判断未知菌的种属。
八十年代初己设计出各种多项生物学试验的套装组合，与电脑贮存的项目内容相对应，即细菌的编码鉴定法，很快在全球得到了重视，迅速推广应用。
随后，在上述编码鉴定的基础上，又开发研究了各种类型的半自动和全自动的细菌鉴定药敏分析仪器。
抑菌测试标准
抑菌测试标准抑菌测试标准是一种用于评估和比较不同产品或材料的抗菌性能和效果的标准化的测试方法。
这种测试方法通常用于医疗、食品、化妆品、日用品等领域，以确保产品的抗菌性能达到预期效果，从而保证产品的安全性和有效性。
下面将详细介绍抑菌测试标准的概述、测试方法、应用领域和发展趋势等方面。
一、抑菌测试标准的概述抑菌测试标准是一种通过在一定条件下培养细菌，并观察和比较不同产品或材料的抗菌效果的标准化的测试方法。
这种测试方法可以评估产品或材料的抗菌性能和效果，以及其对于不同细菌的抑制作用。
抑菌测试标准通常由政府机构或行业协会制定和发布，以确保不同产品或材料的抗菌性能能够进行比较和评估。
二、抑菌测试标准的测试方法抑菌测试标准的测试方法包括以下步骤：1.选取测试菌种：根据产品或材料的特点和用途，选取具有代表性的菌种进行测试。
常见的测试菌种包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等。
2.制备菌悬液：将选取的菌种接种在营养培养基中，培养一定时间后，将细菌悬挂在无菌生理盐水中，制备成一定浓度的菌悬液。
3.接种菌悬液：将制备好的菌悬液涂抹或滴加在测试产品或材料的表面或与材料接触的介质中。
4.培养：将接种后的样品在一定温度和湿度条件下培养一定时间，使细菌充分生长繁殖。
5.观察：观察不同样品对于细菌生长的抑制作用，记录各个样品上的细菌数量和生长情况。
6.数据分析：根据观察结果，对不同样品的抗菌性能进行比较和分析，得出各个样品的抑菌率、杀菌率等指标。
7.结果判定：根据抑菌测试标准的判定标准，对各个样品的抗菌性能进行评级，并给出相应的评价报告。
三、抑菌测试标准的实际应用抑菌测试标准在实际应用中具有广泛的应用领域，例如：1.医疗领域：用于评估医用材料、医疗器械等的抗菌性能和效果，以保证医疗安全和有效。
2.食品工业：用于评估食品包装材料的抗菌性能和效果，以保证食品的卫生和质量。
3.化妆品行业：用于评估化妆品的抗菌性能和效果，以保证产品的安全性和有效性。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)方法
测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。
二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
抑菌活性实验方案
抑菌活性实验方案抑菌活性实验方案薄层层析(TLC)是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。
(1) 初始发酵培养基的筛选在250 mL三角瓶装100 mL基础培养，将种子培养基以6%接种量接入各种基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养5d，测定不同培养基下发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳基础培养基。
(2) 发酵时间的确定将活化的种子培养基以6%接种量接入筛选出的基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养不同时间段，测定每个时间段发酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳发酵时间。
(3) 发酵初始pH值的初步确定将优化后碳氮源的基础培养基的pH分别调成3、5、7、9、11，然后再按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同pH培养基发酵液无菌滤液对供试病原菌的抑制率，确定初始pH范围。
(4) 发酵温度的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，分别在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃，170 r/min培养一定时间后，测定不同温度下发酵所得发酵液对供试病原菌的抑制率，确定发酵温度范围。
(5) 发酵接种量的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，分别按2 %、4 %、6 %、8 %、10 % 接种种子培养基，在28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同接种量对发酵液抑菌活性的影响，确定发酵接种量范围。
(6) 发酵转速的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，28 ℃、以100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、210 r/min培养一定时间后，测定不同发酵转速对发酵液抑菌活性的影响。
(7) 发酵装液量的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，在250 mL锥形瓶中装入50 mL、75mL、100 mL、125 mL、150 mL，按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min 培养一定时间后，测定不同发酵装液量对发酵液抑菌活性的影响。
酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性方法的建立
酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性方法的建立酶标仪是一种常用的实验仪器，可用于测定抗菌物质的抑菌活性。
建立酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性的方法包括以下几个步骤。
首先，准备实验所需材料和试剂。
包括抗菌物质、培养基、菌种、酶标板、缓冲液和底物等。
抗菌物质可以根据需要选择合适的浓度进行稀释，培养基应选择适合菌株生长的培养基。
其次，将菌种接种于含有适当浓度抗菌物质的培养基中，培养菌株至适当的生长期。
可以通过测定菌株生长曲线的方式确定最佳时间点。
同时，设置对照组，即只包含培养基和菌株的组。
然后，制备酶标板。
将适量的抗菌物质加入到已经灭菌的酶标板孔中，使其吸附在孔底。
然后加入已培养的菌株和培养基混合液至孔中，使其与抗菌物质相互作用。
接下来，进行酶标反应。
将底物加入到酶标板孔中，使其与菌株代谢产生的酶反应，产生特定信号。
可以选择适当的底物，使其与菌株代谢产物有特异性反应。
比如，选择显色底物，可以观察到颜色的改变。
最后，使用酶标仪进行读数和分析。
将酶标板放入酶标仪中，设定相应的波长和参数，读取吸光度值。
通过测定吸光度的变化，可以评估抗菌物质对菌株的抑菌活性。
同时，通过与对照组的比较，可以确定抗菌物质对菌株的特异性抑菌效果。
需要注意的是，在建立酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性方法时，要进行多次重复实验，以确保结果的准确性和可重复性。
同时，还需要进行统计学分析，对数据进行处理和解释，以得出可靠的结论。
总之，酶标仪可以作为一种快速测定抗菌物质抑菌活性的方法，通过读取吸光度值来评估抗菌物质的效果。
建立此方法需要依次进行实验准备、菌株培养、酶标板制备、酶标反应和数据读取等步骤，并根据实际需要进行多次重复实验和统计学分析。
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Advances in Microbiology 微生物前沿, 2014, 3, 29-35Published Online June 2014 in Hans. /journal/amb/10.12677/amb.2014.32004Establishment of Rapid DeterminingMethod for Antibacterial Activity byMicroplate ReaderZixiong Zhou1, Qinhua Huang2, Shuang Zhu2, Lin Zhou2*1School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou2Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates, School of Biosciences andBiopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, GuangzhouEmail: zzxyaoji@, *bio_zhoulin@Received: Apr. 23rd, 2014; revised: May 28th, 2014; accepted: Jun. 4th, 2014Copyright © 2014 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractTo investigate the main factors influencing the antimicrobial activity by microplate reader method for high throughput screen antimicrobial substances, the inhibitory rate of staphylococcus aureus was determinated against four typical antibiotics (kanamycin hydrochloride, terramycin, ampicillin, vancomycin) under different culture conditions. The result showed that the concentration of the drug, culture conditions and culture time will affect the inhibitory rate of Staphylococcus aureus.With bacterial concentrations of 5 × 105 cfu∙mL−1, static culturing, incubation time of 6 h, the inhi-bitory rate of kanamycin hydrochloride, terramycin, ampicillin, vancomycin was 57.4%, 52.8%,57.4%, 52.8% respectively with the concentration of 100 μg/mL antibiotic, while the inhibitoryrate was 55.6%, 36.1%, 56.5%, 36.1% respectively with the concentration of 10 μg/mL antibiotic, and the inhibitory rate was 46.3%, 10.0%, 52.8%, 50.0% respectively with the concentration of 1 μg/mL antibiotic. The precision and repeatability of the assay were good. There is no significant difference, in the inhibitory rate, between the microplate reader method and tube turbidimetry method from 2010 China Pharmacopoeia. The established microplate reader method could be ap-plied to high throughput screen of antibacterial substances.KeywordsMicroplate Reader, Antimicrobial Activity, High Throughput Screen酶标仪快速测定抗菌物质抑菌活性方法的建立*通讯作者。
周子雄1，黄庆华2，朱爽2，周林2*1广东药学院中药学院，广州2广东药学院生命科学与生物制药学院，广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广州Email: zzxyaoji@, *bio_zhoulin@收稿日期：2014年4月23日；修回日期：2014年5月28日；录用日期：2014年6月4日摘要对酶标仪法测定药物抑菌活性的主要影响因素进行研究，为基于酶标仪法快速筛选抑菌活性物质提供实验依据。
以金黄色葡萄球菌标准菌株为受试菌株，测定代表性抗菌药物(盐酸卡那霉素、土霉素、氨苄青霉素、万古霉素)，在不同培养方式(静置培养、振荡培养)、不同培养时间条件下，对金黄色葡萄球菌的抑菌率。
结果表明药物浓度、培养方式、培养时间显著的影响抑菌活性的测定，在金黄色葡萄球菌浓度约5 × 105 cfu∙mL−1、37℃静置培养6 h的条件下，盐酸卡那霉素、土霉素、氨苄青霉素、万古霉素浓度为100 μg/mL时，抑菌率分别为57.4%、52.8%、57.4%、61.1%；浓度为10 μg/mL时，抑菌率分别为55.6%、36.1%、56.5%、56.0%；浓度为1 μg/mL时抑菌率分别为46.3%、10.0%、52.8%、50.0%。
方法的精密度和重现性良好。
在设定的测试条件下，酶标仪法与2010版中国药典中试管浊度法没有显著性差异，可用于抗菌活性物质的高通量筛选。
关键词酶标仪，抑菌活性，高通量筛选1. 引言药物单体或组分抑菌活性的评价是抗菌药物高通量筛选的关键环节，常用的抑菌活性筛选方法有平皿法、试管浊度法[1]和琼脂扩散法。
《中国药典》2010年版二部中的试管浊度法采用的是分光光度分析，分光光度分析在药物分析等领域发挥着重要作用[2]，但该方法工作量大，操作繁琐，测定时间长，试剂消耗较大，对于微量物质，难以检测[3]。
酶标仪是酶联免疫测定的常规仪器，主要应用在医药学领域[4]，其测定的原理是建立在物质吸收光谱及可见光比色技术基础上的。
由于酶标仪具有检测快速、应用样品微量的优点，适合用于大规模样品的快速检测[5] [6]，并应用于抑菌活性的研究[7] [8]。
我们在实验中发现，针对同一个样品在不同批次中测定的抑菌活性数据常常缺乏一致性，应用于高通量筛选抑菌活性物质时存在不确定性的因素。
采用代表性的抗菌药物对酶标仪法测定抑菌活性的影响因素进行研究，从而将测定过程标准化是开展高通量筛选过程的关键。
本文重点研究在不同抗生素、不同培养条件对受试微生物抑菌活性的影响，为抗菌药物高通量筛选实验方案的标准化提供依据。
2. 材料与方法2.1. 试剂金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)由广州威佳科技有限公司提供；氨苄青霉素(AMP)、万古霉素(VAN)、土霉素(OTC)、盐酸卡那霉素(KAN(HCl))，杭州天和微生物试剂有限公司；蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸出粉，浙江省富阳市杭富生物制品厂；氯化钠，广州化学试剂厂；磷酸二氢钾，天津市福晨化学试剂厂；氢氧化钠，天津市百世化工有限公司；96孔板，上海蔚宏生物科技有限公司。
2.2. 菌种活化配制LB液体培养基，每试管分装5 mL，于高压锅内121℃灭菌30 min。
无菌条件下，挑取平板保存的金黄色葡萄球菌单菌落接入试管，置于摇床37℃、170 r/min、培养14~16 h。
2.3. 抗生素溶液的配制精密称取100 mg粉末状抗生素样品，加入1 mL灭菌纯水混匀，用0.22 μm滤膜过滤除菌，置于−20℃冻存备用。
利用LB液体培养基稀释抗生素，使氨苄青霉素终浓度依次为100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/m L、0.01 μg/mL。
盐酸卡那霉素、土霉素、万古霉素的浓度梯度为100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL。
2.4. 菌液的配制取活化过夜的金黄色葡萄球菌菌液按1%接种量接入含5 mL LB液体培养基的试管，置于摇床37℃、170 r/min、培养3.5 h，10,000 r/min离心5 min，弃上清。
加入1 mL磷酸缓冲液，吹打均匀，稀释至浓度为5 × 105 cfu∙mL−1，备用。
2.5. 抑菌活性测定2.5.1. 静置和震荡培养的影响各取5 μL浓度为5 × 105 cfu∙mL−1的受试菌加入5 mL分别含10 μg/mL、1 μg/mL氨苄青霉素的LB 培养基。
从上述菌悬液中各取250 μL于两块96孔板上，取等体积不含氨苄青霉素的菌悬液作空白对照，每个样品平行加6个复孔，两块96孔板用保鲜膜包好分别于37℃静置培养、于37℃震荡培养(转速为170 r/min)，培养6 h。
用酶标仪测定菌液的吸光值OD600。
2.5.2. 培养时间和氨苄青霉素浓度的影响各取5 μL浓度为5 × 105 cfu∙mL−1受试菌加至5 mL含0.01~100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
从上述菌悬液中各取250 μL于96孔板上，取等体积不含氨苄青霉素的菌悬液作空白对照，每个样品平行加6个复孔。
测定后将96孔板用保鲜膜包好置于37℃培养箱中培养，分别测定在培养0 h，4 h，8 h，12 h后金黄色葡萄球菌的菌液OD600值。
2.5.3. 不同抗生素的影响各取5 μL浓度为5 × 105 cfu∙mL−1的受试菌分别加入5 mL含盐酸卡那霉素、土霉素、氨苄青霉素、万古霉素的LB培养基中，各抗生素浓度依次为100 μg/mL、10 μg/mL、1 μg/mL。