Westernblot一抗和二抗的选择讲解学习
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求，听起来好像很高级的样子，但是其实咱们普通人也能轻松理解。
今天，我就来给大家讲讲这个话题，希望能够帮助大家更好地进行荧光双染实验。
咱们要明确一点，荧光双染实验是用来检测细胞中特定蛋白的表达情况的。
那么，为什么我们需要选择一抗和二抗呢？因为一抗和二抗可以特异性地识别我们想要检测的蛋白，从而帮助我们找到这些蛋白在细胞中的定位。
那么，如何选择合适的一抗和二抗呢？这里有几个基本的要求：
1. 一抗和二抗要能够特异性地识别我们想要检测的蛋白。
这就意味着，它们不能识别其他无关的蛋白。
否则，我们的实验结果就会被干扰。
2. 一抗和二抗的亲和力要足够强。
这是因为，如果它们的亲和力不够强，它们就不能很好地与我们想要检测的蛋白结合。
这样一来，我们的实验结果也会受到影响。
3. 一抗和二抗的价格要合理。
毕竟，我们做实验是为了得到有用的结果，而不是为了花很多钱买昂贵的试剂盒。
所以，我们在选择一抗和二抗的时候，也要考虑到它们的价格因素。
4. 一抗和二抗要容易保存和使用。
这是因为，有些试剂盒可能需要特殊的条件才能保存稳定，或者需要特殊的操作步骤才能使用。
如果一抗和二抗不能方便地保存和使用，那么我们在实验过程中也会遇到很多麻烦。
选择合适的一抗和二抗对于荧光双染实验来说是非常重要的。
希望大家在进行实验的时候，能够根据这些基本要求来选择合适的试剂盒，从而得到准确、可靠的实验结果。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验，这名字听起来就很炫酷，对吧？其实它就是一个让我们能同时看到两种不同标记物的实验。
没错，就是让我们在显微镜下像变魔术一样，看到细胞中的不同成分。
为了能让这个实验顺利进行，我们得好好挑选一抗和二抗，别小看这两个“小家伙”，它们可是实验成功的关键哦。
接下来，我们就来聊聊挑选一抗和二抗的那些事儿。
1. 选择一抗的基本要求首先，一抗是我们的“主角”，它负责直接和目标抗原结合。
为了让实验更靠谱，我们在挑选一抗的时候有几个基本要求。
首先，得确保一抗的特异性。
简单来说，就是一抗要能够准确地识别目标抗原，不会跟其他东西搭上关系。
你可以把它想象成找一个能只看中你家猫的侦探，千万别让它误认成了邻居家的狗狗。
此外，一抗的亲和力也很重要。
亲和力高的话，一抗就能牢牢地抓住目标抗原，不容易掉链子。
就像是找一个有“强烈吸引力”的好朋友一样，这样才能在关键时刻依靠得住。
1.1 一抗的来源选择一抗时，来源也要考虑清楚。
市面上的一抗分为很多种，有的是从小鼠身上提取的，有的是从兔子身上提取的，甚至还有从山羊身上提取的。
每种来源的一抗都有自己的优点和缺点。
例如，小鼠单克隆抗体常常具有高度的特异性，但可能在某些实验条件下效果不如其他来源的抗体好。
像兔子或者山羊的抗体则可能在灵敏度上表现得更好。
了解这些，才能找到最适合你实验的一抗。
1.2 一抗的纯度一抗的纯度也不能忽视。
想象一下，如果你的试剂里混杂了很多其他东西，就像是在派对上有太多不认识的人一样，肯定会让实验结果变得扑朔迷离。
因此，选择纯度高的一抗非常重要，它能让你减少实验中的干扰，提高结果的准确性。
选择纯度高的一抗，就像在举办一个小型的、只有好友参与的派对，所有人都知道自己干嘛的，大家都玩得开心。
2. 选择二抗的基本要求说完了一抗，接下来咱们聊聊二抗。
二抗是我们的“帮手”，它负责和一抗结合，并且带上荧光标记。
二抗的选择也有讲究，首先是它的特异性。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求，听起来好像很专业的样子，但是其实很简单，就是让我们的实验数据更加清晰明了。
那么，我们该如何选择合适的一抗和二抗呢？接下来，就让我来给大家普及一下吧！我们要明确什么是一抗和二抗。
一抗，就是第一抗体，也就是我们要检测的目标物质；二抗，就是第二抗体，它可以与一抗结合，形成一种复合物，从而使我们能够看到目标物质的存在。
那么，如何选择合适的一抗和二抗呢？1.1 选择一抗选择一抗的时候，我们要考虑到以下几个方面：(1)特异性：一抗要能够准确地识别目标物质，不能误识别其他物质。
这就好比是我们要找一个人，但是他长得像很多人，我们不能因为他长得像别人就把他当成那个人。
(2)灵敏度：一抗要有足够的敏感性，能够在低浓度下检测到目标物质。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人，但是他的出现频率很低，我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性：一抗要具有一定的稳定性，不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人，但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的一抗就是要找到一个既能准确识别目标物质，又有足够敏感性和稳定性的人。
1.2 选择二抗选择二抗的时候，我们要考虑到以下几个方面：(1)特异性：二抗要能够准确地识别一抗，不能误识别其他一抗或者背景分子。
这就好比是我们要找一个人，但是他长得像很多人，我们不能因为他长得像某个特定的人就把他当成那个人。
(2)灵敏度：二抗要有足够的敏感性，能够在低浓度下检测到与一抗结合的复合物。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人，但是他出现的频率很低，我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性：二抗要具有一定的稳定性，不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人，但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的二抗就是要找到一个既能准确识别一抗，又有足够敏感性和稳定性的人。
2.1 一抗和二抗的选择时机在进行荧光双染实验时，我们需要根据实际情况来选择合适的一抗和二抗。
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
一抗二抗的选择 ppt课件
2020/12/12
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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。 间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或 IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度 的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使 一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如 用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体， 必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理， 以除去IgG的干扰。
• 如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化 外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗 体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本 的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解 物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含 IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子 50 and 25 kDa的重链和轻链条带。
• 4.是否经过血清吸附过的二抗
➢ 为减少二抗与样本的非特异性结合，可选择经过 血清吸附过的二抗
➢ 如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克 隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果 对实验的特异性要求很高，选择经过人血清吸附 过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清 吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非 特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最 低。
2020/12/12
用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。 用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。
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• 3.样本的物种
选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与
不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸 序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说 明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体 不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种 尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方 法来预测交叉反应，可应用 Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同 源性比对。
一抗、二抗的选择
IgM
正常情况下，脐血IgM含量为40～240mg/L，血内IgM含量新生儿为50～300mg/L，0.5～6个月为 150～1090mg/L，6个月～2岁为430～2390mg/L，2～6岁为500～1990mg/L， 6～12岁为500～ 2600mg/L，12～16岁为450～2400mg/L，成人为400～3450mg/L。 IgM增高：在胎儿宫内感染、新生儿TORC H综合症、慢性或亚急性感染、疟疾、传染性单核细胞 增多症、支原体肺炎、肝病、结缔组织疾病、巨球蛋白血症，无症状性单克隆IgM病等情况下，； IgM降低：在遗传性或获得性抗体缺乏症、混合性免疫缺陷综合症、选择性IgM缺乏症、蛋白丢失 性肠病、烧伤、抗Ig抗体综合症（混合性冷球蛋白血症）、免疫抑制等情况下，。
一抗、二抗的选择
一抗的选择
• 1.分析实验应用类型 WB（Western Blot 免疫印迹 ） IHC （immunohistochemistry免疫组织化学） ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶联免疫吸附试验 ）
• 2.样本蛋白的结构性质
样本蛋白的结构域 全长蛋白、蛋白片段、多肽、 细菌、细胞
蛋白片断或一种 特殊的同型物或 蛋白全长的某一 区域 用FACS流式检 测活细胞的表面 蛋白
用含此片段域 的免疫原制备 出的抗体。 用含该表面蛋 白的胞外域来 免疫制备的抗 体。
样本的提取和处理过程 某些抗体要求样本经过某些特殊处理， 例如：许多抗体只识别还原和变性的、 表位已暴露不受二级四级结构阻碍的 蛋白样本， 某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。 当选择免疫组化的抗体时，应注意某 些抗体只识别未固定的冷冻的组织， 另一些抗体则适用于无需抗原修复解 交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，
western blot一抗二抗原理
western blot一抗二抗原理Western blot，也叫蛋白印迹，是目前常用的一种蛋白质分析方法。
它的原理是利用抗体特异性识别目标蛋白质，从而检测出目标蛋白质的存在与否、大小以及数量等信息。
Western blot分为以下几个步骤。
1. 蛋白质电泳分离Western blot的第一步是将待检测蛋白质进行电泳分离。
蛋白质在电场中根据其分子量（大小）不同而被分离为不同的带状条带，这些条带被称为蛋白质谱图。
2. 转印分离完毕后，我们需要将带状条带转移到聚丙烯酰胺酰膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上，以便后续的蛋白质定位和检测。
转印过程使用电泳原理，在之前的电泳装置上将PVDF或NC膜和分离完毕的蛋白质谱图叠在一起，经过一定的电流和时间，蛋白质被转移到膜上。
3. 阻断非特异性结合在转移完毕后，需要将膜进行阻断，避免非特异性结合发生。
一般采用的方法是在膜上浸泡含有蛋白质的阻断液（如牛血清白蛋白BSA 或马血清白蛋白MSA）中，这样就能够避免非特异性抗体反应。
4. 第一次抗体孵育接下来就是第一次抗体孵育。
在这一步，我们需要使用目标蛋白质的特异性抗体，将其与膜上的蛋白质结合。
第一次抗体要与目标蛋白质结合，从而使后续反应中的第二次抗体只能结合到第一次抗体上，不会与膜上其他蛋白质结合。
通常在孵育完毕后，需要进行多次的洗涤步骤，去除未结合的第一次抗体。
5. 第二次抗体孵育第二次抗体孵育是Western blot中的关键步骤之一。
这里的第二次抗体是针对第一次抗体的特异性抗体。
第二次抗体的发光物质（如酶或化合物）通常与第二次抗体结合，使其结合的部位出现发光，从而证明目标蛋白质的存在与否。
总之，Western blot的原理是通过特异性抗体的结合实现蛋白质定位和检测。
这种分析方法广泛用于分子生物学研究中，尤其是蛋白质鉴定和分析方面。
它是一种可靠、有效的检测方法，同时也具有一定的局限性，需要根据实际情况进行优化和改进。
WB检测抗体如何选择(下)
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。
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W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择
Westernblot一抗和二抗的选择
抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻
链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗
广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】
二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
**捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
**捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。
【二抗的种属来源】
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。
然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的
二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。
【二抗的耦联标记】
一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金颗粒。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。
在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
**捷能为您提供上述所有不同类型标记的二抗。
【是否经过血清吸附过的二抗】
为减少二抗与样本的非特异性结合，**捷还能为您提供不同血清吸附的原装进口二抗。
如您的检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果您对实验的特异性要求很高，那我们向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。
一，一抗的选择
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：分析试验应用的类型l 样本蛋白的结构性质l 样本的种属
l 抗体宿主的种类l 抗体的标记和检测l
1.分析试验应用的类型
一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于
WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2.样本蛋白的结构性质
了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑
待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。
l 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。
当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l
3.样本的物种
应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。
4.一抗宿主物种的选择
一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。
如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子50 and 25 kDa的重链和轻链条带。
经过吸附处理的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理，以减少非特异性背景。
例如，如果是小鼠的组织或细胞，那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。
但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。