如何选择二抗

如何选择二抗抗体简介抗体：是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。

单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。

抗体结构：抗体是由四条肽链构成的“Y”形对称的分子，包括两条重链和两条轻链。

在“Y”的尖端部位的氨基酸顺序在不同的抗体分子中差别很大，是负责与抗原进行特异性结合的区域，称为可变区，余下的区域则称为恒定区。

抗体分类抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二抗可以耦联有几种不同的标记，可以是酶，荧光素，或生物素。

抗体特异性产品整个分子(H+L) 特Affinity Purified Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT)异性抗体Peroxidase Conjugated Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT)Fluorescein Conjugated Affinity Purified Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT) Fab 特异性抗体Peroxidase Conjugated Anti--HORSE IgG F(ab)2 (GOAT)Fluorescein Conjugated Affinity Purified Anti-CHICKEN IgG F(ab)2 (RABBIT)Affinity Purified Anti-BOVINE IgG F(ab)2 (GOAT)Fc 或重链特异性抗体Affinity Purified Anti-CHICKEN IgM (mu chain) (GOAT)Cy2 Conjugated Affinity Purified Anti-MOUSE IgG2a (Gamma 2a chain)(RABBIT)Fluorescein Conjugated Anti-MOUSE IgG (gamma chain) (RABBIT)轻链特异性抗体Anti - Kappa Light Chain (B - Cell Marker)AP Goat anti Rat IgG, Light ChainBiotin-SP Goat anti Mouse IgG Light chain specific吸附处理的抗体Cy2-IgG Fraction of Monoclonal Mouse Anti-Rabbit IgG, Light Chain Specific (min X Bov, Gt, Arm Hms)Mouse anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Gt, Ms, Shp Sr Prot)Table 1. 典型的整个IgG分子的二抗如何选择二抗通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到最适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：一抗的物种来源一抗是在什么物种来源的，相应的二抗也要是抗该物种的抗体。

例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，那么你就应当选择抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔体内制备的，那么二抗就应当是抗兔的抗体。

至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。

一抗是属于哪个类或亚类二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。

这通常是针对单克隆抗体而言。

多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体.单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。

如果你不知道一抗是哪一类别或亚类，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

F(ab)2 fragment of Anti-RAT IgG (H&L) (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab)2 fragment of Anti-BOVINE IgG (H&L) (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab)2 fragment of Anti-GOAT IgG F(ab)2 (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab)2 fragment of Anti-GOLDEN SYRIAN HAMSTER IgG (H&L) (RABBIT)Table 2. 典型的F(ab’)2片段的二抗下面总结了几种具有不同特异性的二抗：针对整个抗体分子（H＋L）具有特异性：如抗IgG(H+L)，此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合，即与抗体分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分（见图5）均可反应，抗IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA），因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（kappa链或lambda链）。

针对Fab片段具有特异性：这类抗体与重链轻链均可以结合，由于它们可以与轻链反应，它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

这对Fc片段或重链具有特异性：这类抗体和重链的Fc部分反应，一次它们是类别特异性的（即gamma链特异性抗体只与IgG反应，mu链特异性抗体只识别IgM，依此类推）。

轻链（kappa，labmda）特异性：与所有类别的抗体反应，因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。

经过吸附处理的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理，以减少非特异性背景。

例如，如果是小鼠的组织或细胞，那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。

但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。

选择哪种形式的二抗，是整个IgG分子，F(ab’)2片段，还是Fab片段？整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况。

F(ab’)2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成，这些抗体用在特定的情况中，如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

Fab片段：它们只有一个结合位点，一般用来封闭内源性免疫球蛋白。

选用耦联有哪种探针的二抗？一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。

选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。

对于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。

如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。

Fab fragment Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Cy3 AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)Cy2-conjugated AffiniPure Fab fragment rabbit anti-mouse immunoglobulin G (IgG; H+L)Table 3. 典型的Fab片段的二抗下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验：酶：主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。

比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化，western blot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和western blot.荧光基团：1FITC：FITC是广泛使用的荧光基团，但其最大的缺点是淬灭快，使用抗淬灭剂可以减轻。

2AMCA：常用在多标记实验中，如免疫荧光、流式细胞术。

其缺点是，淬灭快，且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。

3花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更稳定，且在表面荧光显微镜下，Cy2的荧光FITC更强。

Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。

二者常在共聚焦显微实验中作多标记。

但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。

4TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中，也可以使用RRX或TR，但TR会产生较高的背景。

在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，且和这两者的重叠很少。

5PE：常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。

6生物素：生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）发生不可逆反应而紧密结合在一起。

首先加入生物素标记的二抗，在加入耦联有酶或荧光集团的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，后者能够结合于二抗表面的多个位点上，从而极大的放大检测信号。