第四章 沉淀分离法

不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，
因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋
白质分段析出，达到分离纯化的目的。
不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核
酸、多糖等的分离纯化。
（一）基本原理
1. 加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的 混合液）的介电常数减小，而使溶质分子（如 蛋白质分子）之间的静电引力增加，从而促使 它们互相聚集，并沉淀出来。
两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分
子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相
互聚集，发生沉淀。
不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根
据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同
的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。
只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的 两性物质，如酪蛋白。 对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍 有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多 生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。 往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方 法结合起来。
采用该法时必须注意：
溶液pH不会影响到目的物质的稳定性。
等电点沉淀法可用于所需物质的提取，也可用 于沉淀除去杂蛋白及其他杂质，实际工作中普遍 采用该方法作为去杂手段。 如在工业上生产胰岛素时： 先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去 除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大 大提高，有利于后面的操作。
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度
敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。
4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从 溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质 的pI附近。
耗盐少，蛋白质收率也高
5.操作方式的影响
固体， 间歇12h
10
5
饱和溶液， 连续12h 饱和溶液， 连续1.6min
酶活性 U/ml 2.5 饱和溶液， 间歇12h 1
（2）缺点：
① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能 直接用于医药上
盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精 制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析 等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
二、有机溶剂沉淀法
在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量 亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大 分子的溶解度，使其沉淀析出。
无定形沉淀：无规则
条件缓慢变化时，溶质分子有足够时间排列， 有利于结晶形成； 条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不 及排列就析出，形成无定形沉淀。
分 离 效 果
结晶法：高度的选择性（原因：只有同类分子 或离子才能排列成晶体）。 沉淀法：浓缩与分离，但所得的沉淀物聚集多 种物质，或含有盐类，或包裹着溶剂。
作图来表示：
8 dS –— dP 6 4 2 0 20 30
利用不同蛋白质盐析分布 曲线在横轴上的位置不同， 可采取先后加入不同量无 机盐的办法来分级沉淀蛋 白质。
40
50
60
70 P
蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率
2.蛋白质浓度的影响
蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。 随浓度提高，盐用量减少。
(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)
（三）影响盐析的各种因素
无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式
1.无机盐加入量的影响
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 -0.5 -1.0 -1.5 β S0 盐析
1 2 3 4 5 6 μ(离子强度)
蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同 0.50 0 -0.50 -1.00 0 2 4 6 μ(离子强度) 8 10
廉价
(NH4)2SO4 原因
在水中溶解度大，且溶解度随温度变 化小，低温下仍具有较大的溶解度 对大多数蛋白质的活力无损害
常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）
中性盐 0 (NH4)2SO4 Na2SO4 20 70.6 75.4 4.9 -1.6 18.9 34.5 7.8 温度（oC） 40 60 80 100 103 42.2 70.8 101
3.无机盐的离子强度
少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶
剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。 常用中性盐: 乙酸钠、乙酸铵、氯化钠 中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），由于盐
溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机
溶剂的用量才能使沉淀析出。 对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机 溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。
81.0 88.0 95.3 48.3 45.3 43.3 44.4 54.6 63.6 54.1 82.6 93.8
MgSO4
NaH2PO4
盐析效果：阴离子 > 阳离子
尤其以高价阴离子更为明显。 常见阴离子的盐析作用顺序：
PO43- > SO42- > CH3COO > Cl > NO3 > ClO4 > I > SCN
固相析出分离技术
1.概念： 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以 固体形式从溶液中沉淀析出的分离纯化技术。
2.种类
结晶法：析出物为晶体 沉淀法：析出物为无定形固体
3.沉淀和结晶（晶体）的异同点 相同：在本质上同属一种过程（固相析出）
区别：
构成单位（原子、离子或 分子）的排列方式不同 晶体：有规则
4.金属离子
一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合
形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影 响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶 剂用量。 使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的 阴离子存在（如磷酸根）。 常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌
5.有机溶剂沉淀法的优缺点
（1）优点： ① 乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成 品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）； ② 有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差 较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。
2. 水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与 溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏， 导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚， 沉淀析出。
常用于生物大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的
（二）影响沉淀效果的因素
温度
pH
中性盐浓度
金属离子
1.温度的影响 有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度 降低而显著的减小，因此低温下（最好低于0oC） 沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。 实际操作中： 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使
_ _ _ _ _ _ _ _ _
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5
50
60
70
饱和度（%）
操作方式对延胡索酸酶盐析的影响 采用间歇方式所需盐量比连续方式少； 间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。
6.盐析法的优缺点 （1）优点：
① 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放 置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失 活； ② 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀； ③ 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 ④ 设备简单，操作方便。
低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的 增加，蛋白质溶解度增大)
高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)
盐离子部分中和蛋白 质的电性，使分子间 排斥作用减弱
中性盐的亲水性比蛋白质大， 盐离子在水中发生水化作用 从而使蛋白质脱去水化膜， 暴露出疏水区域
_+ +_ H+ + + ++ _ + + +_ ++ + OH_ + ++ +
溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性
作用。
整个操作过程应在低温下进行。 具体操作时： ① 将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷： 蛋白质溶液冷却到0oC左右， 有机溶剂预冷到-10oC以下 ② 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作 时应不断搅拌、少量多次加入。 ③ 使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或 离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入 大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机 溶剂与目的物的接触。
（2）缺点：
① 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，
使用上有一定的局限；
② 采用大量有机溶剂，成本较高。
为节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回
收溶剂。
③ 有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备 都应有防护措施。
三、其他沉淀方法
等电点沉淀法
成盐沉淀法
高分子聚合物沉淀
选择性变性沉淀法
1.等电点沉淀法
温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳 定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于 稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低， 10-15oC。
2.pH的影响 在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂 沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。 pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性： 某些酶的等电点在pH4-5之间，比其稳定的pH范 围低，因此pH应首先满足蛋白质稳定性的条件。 控制pH时应使大多数蛋白质分子带相同电荷， 不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免 共沉。