第四章沉淀法
Cohn经验式
蛋白质溶解度与盐浓度的关系
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率
β和Ks的物理意义
β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的 假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关， 与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质 与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸 铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化 不会超过1倍。
沉淀完全后,让初生成的沉淀与母液一起放置一段时间,这个过程 称为“陈化”。
概述
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备， 且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择
n
2）盐浓度对盐析效果的影响
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越
低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离 子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心 收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度， 使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐 的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易 沉淀。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需PH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
概述
n
n
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
概述
沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收 率和沉淀物的形状都有很大影响。
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。
1）盐析用盐的选择
盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
盐析用盐的选择
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子
概述
沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的， 这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响 这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液 的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度， 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分 离的目的。 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶 液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解 度产生明显的改变。
1. 什么是沉淀法？ 2. 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？
3. 常用的沉淀方法包括哪些？
4. 何谓盐析？其原理是什么？ 6. 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 7. 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 8. 等电点沉析的工作原理是什么？
5. 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？
概述
沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低 而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需 成分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目 前仍广泛应用在工业上和实验室中。
性不强
沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1） 盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8）选择性沉淀法。
4.1 蛋白质的溶解特性
n
n
n
n
蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基 酸组成。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性 氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨 基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外 表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷 电区、亲水区和疏水区构成。
在低离子强度或纯水中，蛋白
质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。 但在高浓度下，蛋白质、酶和 多肽类物质的溶解度随温度上 升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小，热促失水 膜 Ks不随温度而变
pH值
lgS β
8 OA-卵清蛋白 COHb-碳氧血红蛋白 OA ７ ６ ５ ４ ３ COHb 3 4 5 6 7 ８ PH 以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵 沉淀OA时，β随 pH的变化
两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大；
β随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值
盐析影响因素：2）温度的影响
等电点沉淀法
在低的离子强度下，调 pH至等电点，使蛋白质 所带净电荷为零，降低 了静电斥力，而疏水力 能使分子间相互吸引， 形成沉淀的操作称为等 电点沉淀 不同的两性电解质具有 不同的等电点，以此为 基础可进行分离。 生产胰岛素时，在粗提 液中先调PH8.0去除碱性 蛋白质，再调PH3.0去除 酸性蛋白质。
n
虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白 质的溶解度，但它不能体现低盐浓度 （盐溶状态）下蛋白质的溶解度。
分段盐析(fractional salting out)
由于不同的蛋白质溶解度 不同，沉淀时所需的离子 上 强度也不相同， 清 如果需要先除去些杂蛋白， 液 然后在较高的饱和度下， 蛋 沉淀目标蛋白质，则可采 白 用分段盐析 浓 改变盐的浓度，可将混合 度 液中的蛋白质分批盐析分 开。 如半饱和硫酸铵可沉淀血 浆球蛋白，饱和硫酸铵则 0 20 可沉淀包括血浆清蛋白。
蛋白质的溶解特性
n
n
n
蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及 分子周围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所 以其大部分是亲水的，但其内部大部分 是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上 类似的大分子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，
盐析用盐的选择
盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；
（3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，
（4） 不易引起蛋白质变性。
缺点： n（1）水解变酸； n（2）高pH 释氨，腐蚀； n（3）残留产品有影响。
pH=pI
等电点沉淀法
1.0
未沉淀蛋白质的分率
0.8 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 对大豆蛋白质 溶解度的影响
图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。
盐析法特点：
1. 2.
3.
4.
成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。
4.３等电点沉淀法
isoelectric point precipitation
盐析的影响因素：3）蛋白质浓度
沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始 浓度有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高， 会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀 作用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加 一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
盐析
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离 蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分 级中使用，得到了比较满意的结果。
盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋
盐析过程
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水质工程学第4章沉淀与澄清3
—— 清水与固体有清晰界面，该界面等速 下降 ——压缩区内部自上而下，沉速递减
——沉淀过程中，清水区高度不断增加
A澄清液层、B受阻沉降层、C过渡层、D压缩层
拥挤沉淀试验
——利用沉淀过程线分析： Kynch 法、 Fitch 法
——建立沉速—浓度函数关系v=f（C） （多筒试验）：固体通量法、吉冈法
——作用：用于分析静置沉淀；确定水中悬 浮颗粒的沉降特性
1、自由沉淀试验 2、絮凝沉淀 3、拥挤沉淀（高浓度悬浮液的沉淀试验）
自由沉淀试验
自由沉淀一般采用单筒沉淀柱试验确定悬 浮颗粒的沉降特性。
1）试验装置 2）试验方法 3）沉淀效率η的求取
自由沉淀试验
沉淀柱有效水深H，
悬浮物原始浓度为C0。 在时间t1时从水深H处取样测得C1，则认为沉速大于 u1（H/t1）的颗粒均已通过H，残余颗粒必然具有小 于u1的沉速，则沉速小于u1的颗粒与全部颗粒的比 例x1=C1/C0。
——沉淀时间: 絮凝沉淀
因此，设计沉淀池时，除了对表面负荷率有要 求外，还对停留时间、池深、进出水构造、排泥 方式等均有要求。通常，对于静置沉淀得出的试 验结果，在用于设计时还需考虑一定的安全系数。 一般在设计时：
q=q0/1.25~1.75，T=（1.5~2.0）T0
沉淀池
概述
一、平流式沉淀池 (horizontal flow Sedimentation Tank) 二、竖流式沉淀池 (vertical flow ST) 三、斜板（管）沉淀池（tilted-plate ST） 四、澄清池（clarifier，clarification tank）
概述
沉淀池构造根据功能分为五个区:
进水区: 保证进水均匀分布在整个进水断 面上，避免短流，减少死角和紊流影响，提 高容积利用系数。 出水区: 均匀出水(目的同上)，阻拦浮渣 沉淀区: 污水与颗粒分离，工作区 污泥区: 污泥贮放、浓缩、排除 缓冲区: 分隔沉淀区，保证沉下的颗粒不 因水流搅动而再次浮起进入沉淀区。
——沉淀过程中，清水区高度不断增加
A澄清液层、B受阻沉降层、C过渡层、D压缩层
拥挤沉淀试验
——利用沉淀过程线分析： Kynch 法、 Fitch 法
——建立沉速—浓度函数关系v=f（C） （多筒试验）：固体通量法、吉冈法
——作用：用于分析静置沉淀；确定水中悬 浮颗粒的沉降特性
1、自由沉淀试验 2、絮凝沉淀 3、拥挤沉淀（高浓度悬浮液的沉淀试验）
自由沉淀试验
自由沉淀一般采用单筒沉淀柱试验确定悬 浮颗粒的沉降特性。
1）试验装置 2）试验方法 3）沉淀效率η的求取
自由沉淀试验
沉淀柱有效水深H，
悬浮物原始浓度为C0。 在时间t1时从水深H处取样测得C1，则认为沉速大于 u1（H/t1）的颗粒均已通过H，残余颗粒必然具有小 于u1的沉速，则沉速小于u1的颗粒与全部颗粒的比 例x1=C1/C0。
——沉淀时间: 絮凝沉淀
因此，设计沉淀池时，除了对表面负荷率有要 求外，还对停留时间、池深、进出水构造、排泥 方式等均有要求。通常，对于静置沉淀得出的试 验结果，在用于设计时还需考虑一定的安全系数。 一般在设计时：
q=q0/1.25~1.75，T=（1.5~2.0）T0
沉淀池
概述
一、平流式沉淀池 (horizontal flow Sedimentation Tank) 二、竖流式沉淀池 (vertical flow ST) 三、斜板（管）沉淀池（tilted-plate ST） 四、澄清池（clarifier，clarification tank）
概述
沉淀池构造根据功能分为五个区:
进水区: 保证进水均匀分布在整个进水断 面上，避免短流，减少死角和紊流影响，提 高容积利用系数。 出水区: 均匀出水(目的同上)，阻拦浮渣 沉淀区: 污水与颗粒分离，工作区 污泥区: 污泥贮放、浓缩、排除 缓冲区: 分隔沉淀区，保证沉下的颗粒不 因水流搅动而再次浮起进入沉淀区。
第四章 沉淀溶解平衡
同理， 对AgI： c( Ag ) / mol dm 3 9.3 1015
AgI先沉淀
AgCl AgI
10
Question 6
Solution
接上题，随着继续滴加AgNO3, AgI 沉淀到何种程度, AgCl才开始沉淀？
AgCl和AgI一起沉淀时, c(I-)、c(Cl-)和c(Ag+) 同时满足AgI和AgCl的溶度积常数表达式，即
果怎样？
Solution
2H CO 2 H 2O CO 2 ① 加酸 3
θ c(CO2 ) Q Q K sp 3
利于 BaCO3 的溶解。
② 加 Ba 2 或 CO 2 θ c(Ba 2 ) 或 c(CO3 ) Q Q K sp
2 3
促使BaCO3的生成。
Q K sp ， 所以有BaSO 4 沉淀析出。
9
分步沉淀 (Fractional precipitation)
实验
-3溶液中 1dm 1.0 103 mol dm 3 Cl 1.0 10 mol dm I
3
3
逐 加 滴 入 1.0 10 3 mol dm 3 AgNO3
(Le Chatelier H,1850-1936) 法国无机化学家，巴黎大学教授.
12
Question 7
试计算298K时BaSO4在0.10 mol· -3 dm
Na2SO4溶液中的溶解度，并与其在纯水中的
溶解度(1.04×10-5 mol· -3)做比较。 dm
Solution
则：
c(Ba2+) = x mol· -3 dm
θ K sp
执业药师第四章各种沉淀反应
考察常用溶剂极性顺序：水> 甲醇> 乙醇> 丙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 氯仿> 苯> 四氯化碳> 石油醚一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，可大致排列成下列顺序：水→甲醇→丙酮→氢氧化钠水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液。
莨菪碱 > 山莨菪碱 > 东莨菪碱和樟柳碱酸水解的易难顺序为：N-苷＞0-苷＞S-苷＞C-苷。
花色素>二氢黄酮（醇）/异黄酮>黄酮（醇）/查耳酮黄酮类化合物酸性由强至弱的顺序7，4′-二羟基>7或4′-羟基>一般酚羟基>5-羟基极性大小顺序：氧化苦参碱＞羟基苦参碱＞苦参碱极性大小顺序：羧基＞羟基＞氨基＞酰基＞醛基＞酮基＞酯基生物碱沉淀反应碘化汞钾（类白色沉淀）碘-碘化钾（棕色沉淀）硅钨酸（灰白色或淡黄色沉淀）雷氏铵盐与季铵碱生成红色沉淀莨菪烷类生物碱的鉴别反应具生物碱通性，与多种生物碱沉淀试剂反应。
（1）氯化汞沉淀反应氯化汞加热莨菪碱（阿托品）—红色沉淀莨菪碱在氯化汞的乙醇溶液中发生反应生成黄色沉淀，加热后沉淀变为红色发烟硝酸和苛性碱醇液。
莨菪碱或阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱：阳性DDL）樟柳碱：阳性（含羟基莨菪酸）莨菪碱或阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱：阴性糖和苷类化合物最重要的反应：Molish反应试剂：5%α-萘酚乙醇液，浓硫酸现象：液面间产生紫色环醌类显色反应1.菲格尔反应（Feigl反应）范围：醌类衍生物试剂：碱、醛类、邻二硝基苯现象：紫色2.无色亚甲蓝反应苯醌与萘醌专用显色剂，显蓝色斑点。
3.Borntr ger反应羟基蒽醌类化合物遇碱液显红-紫色的反应相应的蒽酚、蒽酮及二蒽酮只显黄色，需经氧化成蒽醌后方变为红色4.Kesting-Craven反应活性次甲基试剂反应。
反应官能团：苯醌和萘醌中未被取代的位置。
现象：蓝绿色或蓝紫色。
黄酮类显色反应1.还原反应（1）HCL-Mg 盐酸-镁粉反应，是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应现象：黄酮，黄酮醇，二氢黄酮（醇）橙红—紫红说明：查耳酮、橙酮、儿茶素、大多异黄酮不显色花青素、部分橙酮、查耳酮单加盐酸也变色（2）四氢硼钠反应方法：生成紫色或紫红色应用：二氢黄酮类专属反应2.与金属盐类试剂的络合反应分子中具有3-羟基，4-羰基或5-羟基，4-羰基或邻二酚羟基的黄酮类化合物（1）三氯化铝显色应用：定性及定量分析现象：鲜黄色荧光（2）铅盐显色中性乙酸铅只沉淀邻二酚羟基或兼有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮；碱式乙酸铅可沉淀一般的酚类化合物。
4.结晶与升华
(2) 一个试样可依次用中性、碱性醋酸铅将试液的组分分成三
部分：
中性 试 液 Pb(OAC)2
沉淀 水洗
沉淀(Ⅰ) 洗液
碱式醋酸铅 滤液(Ⅰ)
沉淀 水洗
沉淀(Ⅱ) 洗液
(3) 脱铅方法 ：
滤液(Ⅱ)
①通H2S气体(使沉淀转化为溶解度更小的PbS↓) ②加入强酸性阳离子交换树脂(使铅离子转移到树脂上）
(2)溶剂的选择： ①溶质在水(A)中溶解度大，在有机溶剂(B)中不溶。 ②溶剂(B)与水(A)互溶。 ③溶剂与提取物无化学作用。 ④无毒性、价廉。
(3)应用 例子：高分子材料中“高聚物”与“添加剂”分离。
高分子材料 ＋溶剂
浓溶液
不断搅拌，逐滴 ＋沉淀溶剂
添加剂＋溶剂 ＋沉淀剂
高聚物 洗涤 纯品高聚物
样品 溶解 溶液 趁热过滤 洗涤 干燥 测熔点
固体杂质 滤液 冷却
产品
固体＋液体 过滤
固体 （纯的样品）
液体 （含杂质）
注意：①杂质溶解度越大；②被提纯物在加热和常温下溶 解度差别越大。则重结晶的回收率越高。
4.2.2 溶剂的选择 (重结晶的关键)
(1)理想的溶剂应符合下列条件： ① 不与被提纯物质起反应。 ② 样品中被提纯的组分在该溶剂中加热时溶解度大而常温
4.1.3 盐析法
(1)原理：在有机物的水溶液中加入大量的无机盐，会使有机物 溶解度减小而沉淀出来。
(2)特点：不会破坏蛋白质、肽、酶等生物活性，处理量大，操 作方便。
(3)盐的种类： ①盐析性盐：能使蛋白质水溶性减小的盐。常用：Na2SO4、
KH2PO4、Na2HPO4、(NH4)2SO4、KOAc、NaOAc、NaCl ②盐溶性盐：使蛋白质的溶解度反而增大。常用：盐酸胍、脲、
第四章：沉淀溶解
沉淀的转化 溶液中溶解0.01molCaSO4，计算 例：欲在1.0LNa2CO3溶液中溶解 欲在 Na2CO3初始浓度的最小值？ 初始浓度的最小值？ 已知 KSP（CaCO3）=5.0×10-9 KSP（CaSO4）=9.1×10-6 解：
CaSO4 = Ca 2+ + SO4
CO32CaCO3
= (m ) (nS) S
m n
n+ m
m− n
S = m+n
Ksp,MmAn mn
m n
S = m+n
名称 AgBr BaSO4 Ag2CrO4
Ksp,MmAn mn
7.1×10-4 1.1×10-5 7.9×10-5
m n
溶解度（mol.L-1）
溶度积 5.0×10-13 1.1×10-10 2.0×10-12
四、络合效应 MA (s) M n+ + A mL ML …MLn
S = [ M ' ] = [ M ]α M ( L ) = [ A]
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
S = [ A][ M ' ] = [ A][ M ]α M ( L ) = K SPα M ( L ) = K ' SP
2 溶度积规则及其应用
2.1、溶度积规则 、
K ap , MA = f (T )
活度积常数
a M = γ M [ M n + ],
a A = γ A[ Am− ]
K sp , MA = f (T , I )
K ap , MA = γ M γ A [ M n + ][ A m − ] = γ M γ A K sp , MA
K sp , MA = [ M n + ][ A m − ]
生物分离工程第四章沉淀分离法
3. 分类 – 与羧基、胺及杂环等含氮化合物结合；如Mn2+、Fe2 + 、Zn2 + 、 Cu2 +等 – 与羧基结合，不与胺及杂环等含氮化合物结合；如Ca2 + 、Ba2 + 、 Mg2 + 、Pb2 +等 – 与巯基结合；如Hg + 、Ag + 、Pb2 +等
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
第四章沉淀滴定法
22
Ksp´=Ksp Pb(Y) C2O4(H) =10-9.7+7.4+0.3=10-2.0
S = [Pb'] =
K
'
sp
= 10-2.0 / 0.2 = 0.05molgL-1
[C2O4 ']
∴在此条件下，PbC2O4不沉淀
此时，CaC2O4沉淀否？
Ca(Y)=1+10-10.6+10.7=100.4
H+
Ksp＝10-9.7
PbY HC2O4－,H2C2O4
p1 H=4.0，[C2O4´ ]=0.2mol·L-1 , [Y´]=0.01mol·L-
C2O4(H) ＝100.3
Y(H)＝108.6
[Y]=[[Y’]/ Y(H)=10-10.6 mol ·L-1
Pb(Y)＝1+10-10.6+18.0＝107.4
Fe3+
Ag+(被测物)
Ag++ SCN- = AgSCN(白) Fe3+ （K=208） FeSCN2+
当[FeSCN2+]= 6 ×10-6 mol/L即显红色
3
Volhard返滴定法
指示剂：铁铵矾FeNH4(SO4)2
标准溶液：AgNO3、NH4SCN 被测物：X- (Cl-、Br-、I-、SCN-)
1.4
AgCl 1.2
1.0
0.001
0.005
c(KNO3)/(mol·L-1)
沉淀重量法中，用I=0.1 时的Ksp计算; 计算难溶盐在纯水中的 0.01 溶解度用Ksp
14
2. 同离子效应—减小溶解度
沉淀重量法总要加过量沉淀剂.
Ksp´=Ksp Pb(Y) C2O4(H) =10-9.7+7.4+0.3=10-2.0
S = [Pb'] =
K
'
sp
= 10-2.0 / 0.2 = 0.05molgL-1
[C2O4 ']
∴在此条件下，PbC2O4不沉淀
此时，CaC2O4沉淀否？
Ca(Y)=1+10-10.6+10.7=100.4
H+
Ksp＝10-9.7
PbY HC2O4－,H2C2O4
p1 H=4.0，[C2O4´ ]=0.2mol·L-1 , [Y´]=0.01mol·L-
C2O4(H) ＝100.3
Y(H)＝108.6
[Y]=[[Y’]/ Y(H)=10-10.6 mol ·L-1
Pb(Y)＝1+10-10.6+18.0＝107.4
Fe3+
Ag+(被测物)
Ag++ SCN- = AgSCN(白) Fe3+ （K=208） FeSCN2+
当[FeSCN2+]= 6 ×10-6 mol/L即显红色
3
Volhard返滴定法
指示剂：铁铵矾FeNH4(SO4)2
标准溶液：AgNO3、NH4SCN 被测物：X- (Cl-、Br-、I-、SCN-)
1.4
AgCl 1.2
1.0
0.001
0.005
c(KNO3)/(mol·L-1)
沉淀重量法中，用I=0.1 时的Ksp计算; 计算难溶盐在纯水中的 0.01 溶解度用Ksp
14
2. 同离子效应—减小溶解度
沉淀重量法总要加过量沉淀剂.
第四章 沉淀的形成与沉淀平衡测验题与答案
A.AgCl
B.Ag2CrO4
C.Mg(OH)2
D.Al(OH)3
15、若将 AgNO2 放入 1.0 dm3 pH = 3.00 的缓冲溶液中，AgNO2 溶解的物质的量是( )。
(已知 AgNO2 Ksp = 6.0×10－4 ， HNO2 Ka = 4.6×10－4 )
A.1.3×10－3mol
5、已知难溶盐 BaSO4 的 Ksp=1.1×10−10,H2SO4 的 Ka2=1.02×10−2,则 BaSO4 在纯水中的溶解度 是____________mol⋅L−1,在 0.10mol⋅L−1，BaCl2 溶液中的溶解度是_______________mol⋅L−1(不 考虑盐效应)。
4、0.05mol⋅L−1Sr2+和 0.10mol⋅L−1Ca2+的混合溶液用固体 Na2CO3 处理,SrCO3 首先沉淀。当 CaCO3 开始沉淀时，Sr 沉淀的百分数为多少?
(已知 K sp,CaCO
3 =2.8×10−9, K sp,SrCO
=1.1×10−10)
3
5、称取纯 Ag,Pb 合金试样 0.2000g 溶于稀 HNO3 溶液中，然后用冷 HCl 溶液沉淀，得到混 合氯化物沉淀 0.2466g。将此混合氯化物沉淀用热水充分处理，使 PbCl2 全部溶解，剩余的 AgCl 沉淀 0.2067g。计算合金中 Ag 的含量及加入冷 HCl 后，未被沉淀的 Pb 的质量。
6、smol⋅L−1；
K
θ sp
s
mol⋅L−1；
7、(1) Pb2＋，Ag＋，Ba2＋；(2) CdS，NiS； 8、10.52； 9、减小；增大
10、
K
θ sp
(MgNH
Ch4 沉淀法(Pricipitation)2
3、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象 ， 、 高浓度的盐能促使蛋白质沉淀或聚结的现象， 还不能很好地从理论上来解释。 还不能很好地从理论上来解释。 Cohn经验方程式： 经验方程式： 经验方程式
Lgs=β-Ks ×I（µ、m） （ 、 ） β=lgS0 I=
1 2
∑ ciZi
2
4、β的物理意义 、 的物理意义 的物理意义: Ks盐析常数的物理意义 盐析常数的物理意义: 盐析常数的物理意义
第二节
盐析法
一、中性盐盐析法
盐析法（ （一）盐析法（Salting-out）的概念和基本原理： ）的概念和基本原理： 1、概念： 、概念： 2、基本原理 （P41） 、 ）
从以上分析可知， 从以上分析可知，在蛋白质溶液中加入中性 盐后会压缩扩散双电层， 电位， 盐后会压缩扩散双电层，降低ζ电位，即中性 盐既会使蛋白质脱水， 盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去， 的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布 朗运动的互相碰撞下， 朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚 集物而沉淀析出。 集物而沉淀析出。
二、等电点沉淀法 (一)等电点沉淀的概念: 等电点沉淀的概念:
（二）操作条件： 操作条件： 离子强度低， 离子强度低 ， pH≈pI（ 略小于 在中性盐 （ 略小于pI在中性盐 存在下） 用无机酸（ 存在下 ） ， 用无机酸 （ HCl、H2SO4 、 H3PO4 等 ） 、 调节pH 调节
由于在等电点附近， 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解 等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率， 因此等电点沉淀法通常与盐析、 因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀 法联合使用 操作时的注意事项： 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点 ）由于无机离子的影响， 通常会发生“漂移” 通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 高 低 （2）溶质的稳定性 ） （3）盐析效应 ）
第四章滴定分析方法及应用沉淀滴定法讲课文档
滴定中［CrO72-］约为5×10-3mol/L较为合适。若反应液体 积为50~100ml，则加入5%（g/ml）铬酸钾指示剂1~2ml 即可。
现在十页，总共四十四页。
二、铬酸钾指示剂法
2.溶液的酸度 K2CrO4指示剂法只能在中性或弱碱性 （pH 6.5~10.5）溶液中进行。
若溶液为酸性（或pH ≤6.5）时，则 C与rOH24+结 合，导致化学计量点时，不能形成Ag2CrO4沉淀。
，其反应如下：
滴定前Ag+（过量）+ X-
AgX↓
滴定时Ag+（剩余）+ SCN-
AgSCN↓（白色）
终点时Fe3++SCN- ［FeSCN］2+（淡棕红色）
现在二十六页，总共四十四页。
四、沉淀滴定法应用
四、沉淀滴定法应用
（一） 滴定液与基准物质
银量法所用的滴定液是硝酸 银和硫氰酸铵（或硫氰酸钾）溶 液。
三、吸附指示剂法
课堂活动 使用吸附指示剂法测定I-或Cl-时，分别最适合
使用哪种指示剂，是何原因。
现在二十三页，总共四十四页。
三、吸附指示剂法
除铬酸钾指示剂法和吸附指示剂法之外，还有 铁铵矾指示剂法。
铁铵矾指示剂法是以铁铵矾［ NH4Fe(SO4)2·12H2O］为指示剂，用NH4SCN或
KSCN溶液为滴定液，在酸性溶液中测定可溶性银盐和 卤素化合物的银量法，根据测定对象的不同，该方法可 分为直接滴定法和返滴定法。
四、沉淀滴定法应用
（二）无机卤素化合物和有机氢卤酸盐的测定 许多可溶性的无机卤化物及某些有机碱的氢卤酸
盐如盐酸麻黄碱，均可用银量法测定。
现在三十一页，总共四十四页。
四、沉淀滴定法应用
现在十页，总共四十四页。
二、铬酸钾指示剂法
2.溶液的酸度 K2CrO4指示剂法只能在中性或弱碱性 （pH 6.5~10.5）溶液中进行。
若溶液为酸性（或pH ≤6.5）时，则 C与rOH24+结 合，导致化学计量点时，不能形成Ag2CrO4沉淀。
，其反应如下：
滴定前Ag+（过量）+ X-
AgX↓
滴定时Ag+（剩余）+ SCN-
AgSCN↓（白色）
终点时Fe3++SCN- ［FeSCN］2+（淡棕红色）
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四、沉淀滴定法应用
四、沉淀滴定法应用
（一） 滴定液与基准物质
银量法所用的滴定液是硝酸 银和硫氰酸铵（或硫氰酸钾）溶 液。
三、吸附指示剂法
课堂活动 使用吸附指示剂法测定I-或Cl-时，分别最适合
使用哪种指示剂，是何原因。
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三、吸附指示剂法
除铬酸钾指示剂法和吸附指示剂法之外，还有 铁铵矾指示剂法。
铁铵矾指示剂法是以铁铵矾［ NH4Fe(SO4)2·12H2O］为指示剂，用NH4SCN或
KSCN溶液为滴定液，在酸性溶液中测定可溶性银盐和 卤素化合物的银量法，根据测定对象的不同，该方法可 分为直接滴定法和返滴定法。
四、沉淀滴定法应用
（二）无机卤素化合物和有机氢卤酸盐的测定 许多可溶性的无机卤化物及某些有机碱的氢卤酸
盐如盐酸麻黄碱，均可用银量法测定。
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四、沉淀滴定法应用