微生物技术 ppt课件

传统的检测方法(如分离培养、生化鉴定等)无法对难培 养或不可培养的致病微生物进行检测， 而且特异性不高、 灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测、预防作用。
因此，发展新的快速检测与鉴定食源性致病微生物的方 法是及时有效地控制和预防致病微生物传播的前提。
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国内外食源性致病微生物检测新技术
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1. 免疫荧光技术
❖ 原理与特点：免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体 活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应 的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种 特异性荧光反应。此技术的主要特点有特异性强、 敏感性高、速度快。
❖ 应用：此技术可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄 球菌毒素、E·ColiO157和单核细胞增生李斯特氏菌 等进行快速检测。王军等建立了养殖大黄鱼病原溶 藻弧菌的荧光抗体免疫快速检测技术。
❖ 免疫学检测技术 ❖ 聚合酶链反应(PCR)等技术 ❖ 生物芯片技术 ❖ 代谢学技术 ❖ 其它呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
❖ 应用：Skjerve等报道了采用免疫磁性分离技术， 从乳及 乳制品、肉类和蔬菜中分离沙门氏菌，其检测灵敏度为 100CFU／g。在英国，此法主要应用于牛奶中大肠杆菌 O157：H7的监测和食品中单核细胞增生李斯特氏菌、副 溶血性弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌)等的检测。在实际应 用中，还可以与直接镜检技术、阳抗技术、酶联免疫试验、 PCR等技术相结合应用。此外， 以免疫磁性分离技术为 基础的免疫胶体金技术已成功应用于O l群霍乱弧菌的检 测。
良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗体 (或抗原)的免疫活性。在ELISA中，常用的酶为辣根 过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)和碱性 磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP) 。国产ELISA试 剂一般都用HRP制各结合物。国外很多ELISA试剂采 用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。
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3. 免疫胶体金技术
❖ 原理与特点：免疫胶体金技术 起源于1971年Faulk等应用电 镜免疫胶体金染色法(IGS)观察 沙门菌。其基本原理是以微孔 滤膜为载体包被已知抗原或抗 体，加入待检标本后，经滤膜 的毛细管作用或渗滤作用使标 本中的抗原或抗体与膜上包被 的抗体或抗原结合， 再用胶体 金结合物标记而达到检测目的。 其特点是单份测定、简单快速、 特异敏感，几分钟就可用肉眼 观察到颜色鲜明的实验结果， 并可保存实验结果。
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近年来，该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用，如微 生物污染、天然毒性物、人兽共患疾病病原体检测等方面的检测分析。
微生物污染：Kryinskiand Heimsch等(1977)首次将ELISA用于食品 沙门氏菌(Salmonella spp．)的检测，并在应用中不断得以发展。目前 有许多种方法，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术 研究最多，检测结果准确可靠。例如对沙门氏菌最低检测量可达 500CFU／g，仅需22h， 比常规方法缩短了3～4d，与金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌 检测系统，实现了整个过程的自动化，全程耗时仅为45min。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一 免疫学检测技术
免疫学检测技术将抗原-抗体反应的特异性与标 记技术(荧光素、放射性同位素和酶)的相结合， 是 一种可以定位、定性和定量的综合技术，具高专一性 和高敏感度。
❖ 免疫荧光技术 ❖ 免疫磁性分离技术 ❖ 免疫胶体金技术 ❖ 酶联免疫吸附检测(ELISA) ❖ 酶联荧光免疫分析技术(VIDAS)
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完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：(1)包被抗原或 抗体的固相载体(免疫吸附剂)；(2)酶标记的抗原或抗 体；(3)酶的底物：(4)阴性和阳性对照品(定性测定)， 参考标准品和控制血清(定量测定)；(5)结合物及标本 的稀释液；(6)洗涤液；(7)酶反应终止液。结合物为 酶标记的抗体(或抗原)，是ELISA中最关键的试剂。
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2. 免疫磁性分离技术
❖ 原理与特点：免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁 性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性的结合，载 有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下， 向磁极方向
聚集，弃去检样混合液，使致病菌不断得到分离、浓缩。 免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养过程，可 特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。
❖ 特点：由于酶的催化效率很高， 间接地放大了免疫反应的结 果，使测定具有极高的灵敏度。 ELISA具有选择性好、结果 判断客观准确、实用性强、检测速度快、样品处理量大、以 及费用低等优点，弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试 手段的不足。
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应用：ELISA技术自二十世纪70年代出现开始，在临 床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视。特别是 随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展， 各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备，单克 隆抗体技术的应用，使得该诊断检测技术在特异性、 灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高，并且在自 动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分 析能力。由于ELISA的技术条件要求低、适用范围宽、 携带方便、且易商品化、操作简便和经济实惠，它已 成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与 分析技术，常以试剂盒的形式出现 。
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4.酶联免疫吸附检测(ELISA)
❖ 原理：1971年Engvall建立了ELISA方法，它以酶或者辅酶 作为标记物，标记抗原或者抗体， 用酶促反应的放大作用来 显示初级免疫学反应，并且利用聚苯乙烯微量反应板(或球) 吸附抗原或者抗体，使其固相化， 在其中进行免疫反应和酶 促反应。根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。
I.国内外食源性致病微生物检测新技术研 究与应用进展
食源性致病微生物是指以食物为载体， 导致人类发生 疾病的一大类微生物（古菌、细菌、真菌、病毒等）。近年 来，全球食品安全事件频频发生， 如美国的“李斯特氏杆 菌事件”、日本的“大肠杆菌0l57流行事件”等，对人类健 康带来很大危害，引起各国政府的全力关注。