利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法
微透析-高效液相色谱法测定米诺环素大鼠血液和脑内的药动学
微透析-高效液相色谱法测定米诺环素大鼠血液和脑内的药动学董文彬;程佳祎;陈爱瑛;郑高利【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》【年(卷),期】2012(17)6【摘要】目的:研究米诺环素在大鼠血液和脑内的药动学。
方法:采用微透析结合高效液相色谱技术,测定米诺环素大鼠血浆蛋白结合率;大鼠尾静脉注射米诺环素,测定给药后10h内不同时间点大鼠血液、海马CA1区中游离药物的浓度。
结果:米诺环素大鼠血浆蛋白结合率为82.08%,给药后迅速进入脑组织,在给药后3.83h左右浓度达到峰值,其后缓慢下降,脑组织的游离药物-时间曲线下面积(AUC0-10h)可达血液的62.42%。
结论:微透析结合高效液相色谱技术可以测定米诺环素的大鼠血浆蛋白结合率,并实现大鼠血液和脑组织中游离米诺环素浓度的动态监测。
结果表明米诺环素易于透过血脑屏障,且能长时间维持较高浓度,从而发挥其神经保护作用。
【总页数】5页(P654-658)【关键词】米诺环素;药动学;血浆蛋白结合率;微透析;高效液相色谱【作者】董文彬;程佳祎;陈爱瑛;郑高利【作者单位】浙江省医学科学院药物研究所;浙江中医药大学药学院【正文语种】中文【中图分类】R964;R917【相关文献】1.基于UPLC-TOF/MS和脑内微透析技术的异嗪皮啶在帕金森病模型大鼠脑内药动学研究 [J], 卢芳;范振群;张颖;周世慧;刘树民;唐波;杨婷婷2.微透析-高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定 [J], 韩进;万海同;别晓东;李金辉;张宇燕3.高效液相色谱法分析大鼠脑微透析液中的去甲肾上腺素 [J], 贺赛琳;岳云;张英民;郝建华;郭徽;盛志勇4.微透析和高效液相色谱法测定大鼠脑内天麻素及天麻苷元含量 [J], 吕允凤5.微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱 [J], 贾兴元;吴安石;岳云;刘敬忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
进展研究一种新的纯化SD大鼠视网膜Müller细胞方法
进展研究一种新的纯化SD大鼠视网膜Müller细胞方法发表时间：2018-11-20T11:30:46.770Z 来源：《兰大学报（医学版）》2018年6期作者：王玉珏李歆张雪咏通讯作者[导读] 目的探讨两种提纯SD大鼠视网膜Müller细胞培养方法的效率。
中南大学湘雅医院眼科长沙 410008【摘要】目的探讨两种提纯SD大鼠视网膜Müller细胞培养方法的效率。
方法采用完全胰酶消化传代法和反复不完全胰酶消化传代法对SD大鼠视网膜Müller细胞进行纯化培养，1个月后行荧光激活流式细胞分选、RT-PCR和免疫荧光细胞化学检测，对Müller细胞的阳性率及纯度进行统计学分析。
结果荧光激活流式细胞分选检测显示，完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度为73.59%，而反复不完全胰酶消化传代法获得视网膜Müller细胞的纯度高达98.32%；荧光显微镜10倍下各分别选取10个非重叠视野，计算表达GS的细胞阳性率。
完全胰酶消化传代法GS阳性表达率为83.2%±5.16%，反复不完全胰酶消化传代法GS的阳性表达率为98.5%±1.08%，采用两样本近似t 检验统计学分析，t=-8.94，P<0.005，两种方法差异有统计学意义。
结论反复不完全胰酶消化传代法更易获得高纯度的Müller细胞，具有细胞密度大、数量多、耗时短且细胞分布均匀等特点，该方法法是一种简单、快速、有效的原代细胞培养技术，可推广应用。
【关键词】传代；纯化；视网膜Müller细胞；胰酶消化Study of Purification culture of SD rat retinal retinal Müller cellsWANG Yu-jue，LI Xin，ZHANG Xue-yong（Department of Ophthalmology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan Provice，410008，P.R.China，）Abstract：【Objective】 To compare the efficiency of two methods of purity culture of SD rat retinal Müller cells in vitro.【Methods】 To purify SD rat retinal Müller cells，traditional pancreatic enzyme passage method and novel repeated pancreatic enzyme passage method were adopted，respectively. A month later，retinal Müller cells was detected by fluorescence-activated cell sorter（FACS），immunohistochemistry technology and RT-PCR to determine the purity. The purity of Müller cells cultured through two methods mentioned above was analyzed by SPSS13.0. 【Result】 FACS showed that the purity of Müller cells from traditional pancreatic enzyme passage method（Group A）was 73.59%，but from repeated pancreatic enzyme passage method（Group B）was 98.32%. Under the fluorescence microscope，about 81.8%±4.87% of the cells were GS positive in Group A，and about 97.6%±1.21% of the cells were GS positive in Group B. The two-sample approximate test analysis demonstrated that the difference between group A and group B was statistically significant（t=-8.94，<0.005）. 【Conclusion】 Repeated incomplete pancreatic enzyme passage method is a more simple and efficiently way to purify retinal Müller cells.Keywords：passage；purification；retinal Müller cell；trypsinizationMüller细胞是人和哺乳动物视网膜中最主要的神经胶质细胞，该细胞从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，其突起广泛分布于视网膜内各类神经元胞体和纤维之间，与各神经元密切接触，使得其在维持视网膜神经元正常功能中发挥着重要的作用[1]。
微透析技术在脑组织研究中的应用
微透析技术在脑组织研究中的应用微透析技术是将推挽灌流和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术，可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。
微透析技术最早应用于脑内是在1972年美国耶鲁大学报道的猴脑的微透析研究，之后微透析即开始应用于对脑内神经递质的改变，药物动力学监测以及一些疾病脑内神经生理改变的研究，至今已有30多年的历史。
本文就微透析技术在脑组织研究中的应用作一综述。
1 微透析技术的原理及探针回收率的测定微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。
这是一种动态连续的取样方法。
简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。
微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样，透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品，而且被透析动物可以小到老鼠一般大小。
通过微透析技术可以单独取得细胞外液，因此可对大脑神经递质进行活体监测［1］，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样前样品处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品的稳定性，而且随着现代技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化控制。
微透析试验中一个重要的步骤是要测定微透析探针的回收率(透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度之比)，由于微透析是在非平衡条件下取样，所以所测得的透析液中化合物的浓度只是探针周围样品基质中该化合物浓度的一部分。
微透析_高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定
本实验采用微透析技术 将透析 探针埋 入动物 的脑中, 透 析探针可除去分子量大 于 30 000 的 分子 [ 4, 5] , 对周围 组织损 伤 很小, 取 样 量少, 并 且 多位 点 多时 点采 样 进行 动态 监 测。 样品不经预处理, 灌流速度稳定在 31 0 L L /m in可使回收率提 高。
雄性 SD大鼠以水合氯醛 ( 400 m g/kg)腹 腔麻醉, 固定在 立体 定 位 仪 上, 将 透 析 套 管 定 位 于 右 侧 纹 状 体 (前 囟 前 01 2 mm, 旁开 315 mm, 皮层下 512 mm )并 用小螺钉 固定。开 启透析灌流系统, 调节恒 流泵控制液流速 310 LL# m in- 1, 透 析探针与人工脑脊液灌 流系统 直接相 接。灌流平 衡 120 m in 后, 每 15 m in收 集 1管, 每管 30 LL, 共收 集 8管透 析液。收 集的透析液立即放 入 - 20 e 冰箱保存。 6 OPA 柱前衍生
的含量。结果: 该体系可在 30 m in内对脑脊液 中 4种氨 基酸实现良 好的分离, 4种 氨基酸在 01625- 10 Lmol/L浓
度范围内与色谱峰面积线性关系良好, 保留时间分别是天门冬氨酸 41392 m in、谷氨酸 51592 m in、牛磺酸 131 625 m in、
C - 氨基丁酸 141833 m in。结论: 本方法准确、灵敏、方便、重复性好, 可用于微透析样品中氨基酸的含量测定。
液相分析采 用梯 度洗 脱, 缩短 分析 时间, 改 善峰 形 和提 高样品的检测灵敏 度。选用 KH 2 PO4 缓 冲液 配制流 动相, 其 浓度为 01 1 m ol/L, 如果浓度 过高会 破坏键 合相的 稳定性, 对 色谱柱的损 害较 大。另外, 缓 冲液 一 定要 用低 浓度 的, 临用 前现 配, 并 用 01 22 Lm 滤 膜 过 滤。水 用 超 纯 水 系 统 去 除 杂质。
LC_MS_MS法测定脑微透析液中乙酰胆碱的浓度
LC-M S/M S法测定脑微透析液中乙酰胆碱的浓度彭娟,范斌3,于友华,王丹巧,焦玥,吴晓霞(中国中医科学院医学实验中心,北京100700)摘要 目的:建立能够灵敏、特异、准确、可靠地测定脑微透析液中乙酰胆碱浓度的分析方法,用于药物干预下脑神经递质变化的研究。
方法:建立乙酰胆碱液质联用检测方法,条件是ESI(+)离子源,MRM扫描检测离子对为乙酰胆碱m/z146→87,氘代乙酰胆碱-d9(内标)m/z155→87。
开展方法学考察,以验证新建分析方法的准确性、精密度等,在此基础上将该方法用于分析大鼠脑微透析手术后的实际样品,以验证新建分析方法的适用性。
结果:乙酰胆碱浓度在010292～1146ng ・mL-1范围内线性良好(r=019979),检测限为0100292ng・mL-1;高、中、低浓度的准确度为9611%～11117%;日内精密度(n=6)为118%～718%,日间精密度(n=3)为210%～1912%。
结论:应用LC-M S/M S技术建立不使用胆碱酯酶抑制剂测定大鼠脑微透析液中乙酰胆碱的方法迅速、灵敏、可靠。
关键词:乙酰胆碱;内标氘代乙酰胆碱-d9;液质联用中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2009)09-1470-05HP LC-M S/M S deter m i n ati on of acetylcholi n ei n m i crodi a lys ates fro m rats bra i nPENG Juan,F AN B in3,Y U You-hua,WANG Dan-qiao,J I A O Yue,WU Xiao-xia(Experi m ental Research Center China Acade my of China Medical Sciences,Beijing100700,China)Abstract O bjecti ve:T o devel op a sensitive and reliable method f or deter m inati on of acetylcholine in m icr odialy2 sates fr om rats brain1M ethods:The detecti on was perf or med byMRM mode via electr os p ray i onizati on(ESI)s ource operating in the positive i onizati on mode;The p recurs or-t o-p r oduct i on transiti ons of the analyte acetylcholine is m/z146→87with internal standard(acetylcholine-d9)at m/z155→871The op ti m al i onizati on and frag mentati on conditi ons,as well as liquid chr omat ographic ones,t o detect acetylcholine were devel oped and validated.The ne w devel oped analytical method was further app lied in deter m inati on of acetylcholine in m icr odialysates fr om rats brain after intracerebral perfusi on of6-hydr oxydopa m ine(6-OHDA).Results:The method was linear over the concen2 trati on range of010292-1146ng・mL-1(r=019979);The li m it of quantificati on is0100292ng・mL-1;The ac2 curacy was9611%-11117%;The intra-and inter-day p recisi on values were118%-718%(n=6)and210% -1912%(n=3),res pectively.Conclusi on:The fully validated LC-MS/MS method has been successfully ap2 p lied t o deter m inati on of acetylcholine in m icr odialysates fr om rats brain.Key words:acetylcholine;internal standard(acetylcholine-d9);LC-MS/MS乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)是一种经典的兴奋性神经递质,通过结合特异受体,在神经细胞之间或神经细胞与效应器细胞之间中起着信息传递作用。
成年大鼠脑透析液和血清中褪黑素含量的测定
成年大鼠脑透析液和血清中褪黑素含量的测定孟涛;郑志竑;叶婧;林玲【摘要】目的：采用高效液相色谱（HPLC）‐荧光法和酶联免疫（ELISA）法测定成年大鼠脑微透析液及血清中的褪黑素（MLT）含量，比较2种检测方法的灵敏性、准确性及可靠性。
方法将微透析引导管置入正常成年大鼠纹状体内1周后，采用脑微透析技术动态收集2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00的透析液，并于次日22：00行尾静脉取血；用HPLC‐荧光法和ELISA法分别测定透析液及血清样本中的MLT水平。
结果HPLC‐荧光法测定MLT检出限为0．1 pg／mL ，在1．0～500 pg／mL之间呈线性关系，回归方程 y＝10446 x ＋8603．5（r＝0．9987，P＜ 0．001），日间、日内精密度均＜6％；ELISA 法检出限为5．92 pg／mL ，检测线性范围为12．35～1000 pg／mL。
用HPLC‐荧光法测定2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00大鼠脑透析液中的MLT含量分别为（32．99 ± 2．22），（18．25 ± 2．27），（4．03 ± 1．70），（2．92 ± 1．08），（12．08 ± 1．77）和（21．83 ± 2．04）pg／m L ，具有明显的昼夜节律性，探针回收率为12％～13％；22：00血清中的MLT含量为（82．62 ± 8．09）pg／mL ，提取回收率＞90％，且血清与透析液中的MLT水平呈高度正相关（r＝0．987，P＜0．001）；用ELISA法测定血清中的MLT含量为（81．31±9．62）pg／mL ，且用2种方法测定血清中MLT差别无统计学意义（P＝0．115）。
结论用HPLC‐荧光法测定大鼠脑微透析液和血清中的MLT 含量具有灵敏、快速、准确、重复性好等特点，且HPLC‐荧光法和ELISA法测定血清中的MLT具有较好的一致性。
大鼠脑脊液抽取的新方法
图 1 大鼠固定示意图
收稿日期： 2011 － 06 － 28 * 基金项目： 国家自然科学基金（ No． 30870854） ； 北京市教委科技 创 新 平 台 项 目 （ PXM2011 _014226 _07 _000070 ） ； 北 京 市 优 秀 人 才 基 金 D
类（ 2011D005018000007） 资助 作者简介： 任长虹 （ 1974 － ） ，女，博士。研究方向： 神经生物学。E-mail： ren97hong2001@ yahoo． com． cn 通信作者： 吉训明 （ 1970 － ） ，男，主任医师。研究方向： 神经外科脑血管病的机制及治疗研究。E-mail： jixm70@ hotmail． com
櫴毷
第 29 卷 第 1 期 2012 年 2 月
櫴櫴櫴櫴櫴毷 技术·方法
实验动物科学 LABORATORY ANIMAL SCIENCE
Vol． 29 No． 1 February 2012
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櫴毷
大鼠脑脊液抽取的新方法*
任长虹1 高明清1，2 曹金强1，3 李 宁1 Kevin K． W． Wang4 吉训明1
大鼠固定后通过触摸找到枕骨嵴occipitalcrest如果是初学者为了明确具体位置可以在此处用记号笔标识大鼠头部固定后如果角度适中隐约可见枕骨嵴后有一肌肉间隙以枕骨嵴下mm处的肌肉间隙处为进针点用手触摸有三角形凹陷进针角度与身体平行即针与头部的角度约为135图2针尖坡面向上缓慢向前进针到小脑延髓池cisternamagna深度约为cm
脑脊液（ Cerebro-Spinal Fluid，CSF） 为无色透明 的液体，充 满 在 各 脑 室、蛛 网 膜 下 腔 和 脊 髓 中 央 管 内，由脑室中的脉 络 丛 产 生［1］。 若 中 枢 神 经 系 统 发 生 病 变 ，神 经 细 胞 代 谢 紊 乱 ，将 使 脑 脊 液 的 性 状 和 成 分发生改变。因此，大 鼠 脑 脊 液 常 被 用 于 脑 损 伤 机 制 、生 物 标 记 物 、药 物 治 疗 等 研 究 领 域 中 ，但 是 ，由 于 脑脊液提取过程复 杂，且 容 易 刺 穿 延 髓 致 使 大 鼠 死 亡，脑脊液提取的成 功 率 低 也 是 许 多 实 验 室 面 临 的 问题。因此，本文将 介 绍 一 种 简 便 易 行 的 大 鼠 脑 脊 液 的 提 取 方 法 ，为 大 鼠 脑 脊 液 的 相 关 研 究 提 供 参 考 。
基于UPLC—TOF／MS和脑内微透析技术的异嗪皮啶在帕金森病模型大鼠脑内药动学研究
药代 动 力 学行 为 ， 特 别 是病 理 状 态 下 的 实验 动 物 模型 ， 对合理利用该药物 ， 尤 其 是 明 确 用 药 剂 量
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ — ０ ５ — ０ ４ 修 回 日期 ：２ ０ １ ２ — ０ ６ — ０ ５
世界科学技术一 中医药现代化 ★中药研究
后实验 。
９ １ ． ２ ｔ ｘ ｇ ・ ｍ Ｌ 标准 品溶液 。 并将其稀 释成 １ ８ ． ２ ４ ｎ ｇ ・ ｍ Ｌ 和 ９ １ ． ２ ｎ ｇ ・ ｍ Ｌ 的对 照品溶液 ， 前 者分别 进样
１ 、 ３ 、 ６ Ｌ，后 者 分 别 进 样 ２ 、 ３ 、 ４ 、 ５ 、 ６ ｌ ｘ Ｌ， Ｕ Ｐ Ｌ Ｃ—
１ ． ４ ９ ｍｉ ｎ、 １ ８ ． ６ ９± １ ． ６ ７ ｍｉ ｎ， Ｃ￣ ＝ ６ ２ ６ ． ３ ８＋ ８ ９ ． ６ ９ ｎ ｇ・ ｍＬ～、 １ ４ ７ １ ． ３ ０＋１ ６ ３ 。 １ ０ ｎ ｇ。 ｍＬ一， ｔ 一 ＝１ ５ ｍｉ ｎ、 １ ５ ｍｉ ｎ， ＡＵＣ ｏ — ｔ ＝１ ４ ０ １ ４ ． ９ ５ ￣ ２ ９ ２ ７ ． ２ １ ｎ ｇ・ ｍｉ ｎ・ ｍＬ ～、 ３ ５ ４ ３ １ ． ８ ６ ￣ ５ ３ ０ ３ ． ３ ６ ｎ ｇ・ ｍｉ ｎ・ ｍＬ ～， ＡＵＣ ０ 一 ＝ １ ６ ２ ４ ５ ． ５ ４ ￣ ３ ４ ４ ６ ． １ ５ ｎ ｇ・
校正后 ， 使 用 Ｗｉ ｎ ｎ ｏ ｌ ｉ ｎ ６ ． １ 计算相应 药动学参数 。结果 ： 行为学测试及免 疫组化 实验证明模型制作成 功。在给 予相关模 型大鼠异嗪 皮啶 １ ０ ｍ ｇ ・ ｋ ｇ 和 ２ ０ ｍ ｇ ・ ｋ ｇ 后 ， 相应的药动学参数分别为 ， ｈ ｎ ＝ １ ７ ． ６ ３ ＋
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利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。
标签：微透析；透析液；立体定位；rACC脑区；大鼠前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。
已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。
微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。
该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。
目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。
在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。
但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。
笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。
1 定位1.1 微透析探针的选取微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。
本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。
EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。
1.2 埋置导管定位手术雄性SD大鼠，250～270 g，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠（40～50 mg/kg）成功后，将其固定于脑立体定位仪上。
切开头皮，清除皮下筋膜，暴露颅骨，以前囟（Bregma）点为0点，根据Paxinos & Watson图谱[13]rACC坐标，AP：+2.6 mm，ML：±0.6 mm，DV：-2.8 mm，见图2。
将导管埋置于rACC定位标记点，插入导管对应的内芯，拧上螺帽，后用牙托水泥固定。
固定时应注意将头皮和牙托水泥接缝处分开，有助于脓血的渗出。
术后3～5 d 即可进行微透析实验。
实验结束后向取样部位注入染料，病理切片观察定位是否准确。
2 基本原理将带有透析膜的探针定位于需采样的生物体组织，用一种非常精密的注射泵进行液体灌流，推送溶液至探针处，以达到与组织内欲取出测量的低分子量物质，进行透析交换。
交换后的透析液被采集，通过高效液相或其他仪器做进一步的分析，见图3。
3 取样3.1 取样前准备温度恒定24 ℃，灌流液选用复方氯化钠溶液，因为其pH 值和渗透压均和脑脊液相似，以此作为人工脑脊液进行灌流，过滤器过滤后，备用。
进行取样前连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置。
准备1 mL的注射器，充满三蒸水，固定于微透析泵上，打开微透析泵低速（1 μL/min），使微透析管道内充满三蒸水，以充分排出管内气体。
进行探针检测：用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头（长进短出，黄进蓝出）；以低速（1 μL/min）向探针注射三蒸水，若整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象出现，则该探针正常，可以使用；若观察到探针膜某处成股状流出三蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针。
3.2 清醒大鼠取样取样装置和取样示意图，如图4、5所示，在取样前应先将大鼠放入装置适应15 min，以减少环境对动物的新异刺激。
开启透析泵使灌流液充满整个管路，然后将导管中的内芯取出，装备插入探针，插入探针前用三蒸水或人工脑脊液多次冲洗导管内，防止导管内有异物堵塞导管，损毁探针。
使大鼠处于气体麻醉状态下，迅速插入并固定探针，将大鼠放回装置待其清醒后，打开恒流注射泵开始灌流透析。
用复方氯化钠以2 μL/min的速度收集样品，因为插入探针时的刺激、微透析液中混有破碎细胞的细胞内成分等都会对检测结果造成一定的影响，所以开始取样后60 min（平衡时间）透析液弃去不用，待目标神经递质检测结果达到稳定，便可定时收集样本至-80 ℃保存。
若收集的脑脊液用来测单胺类的神经递质，则需在收集管中加入稳定剂（稳定剂：收集的脑脊液=1︰4）。
稳定剂配制方法：若配制100 mL稳定剂：0.01 g Na2EDTA，220 μg抗坏血酸，0.6 mL无水乙酸，加水至100 mL。
收集样本时除了要时刻观察探针是否脱出外还应注意每管收集液的体积是否大致相同，如出现明显的差异则说明探针的透析膜出现损害或者微量泵出现偏差，应立刻停止实验，确定问题出处后重新开始。
另取样速度和平衡时间的选择要适当，两者成反比，当速度过快时，平衡时间长，透析液中神经递质含量过低。
当速度过慢时，平衡时间短，但不利于实验设计。
取样方法成功的标准为：平衡时间后，每隔10分钟连续收集三管透析液，能够在透析液中检测出目标神经递质的含量，并且几次检测的数据不具有统计学差异，可认为目标神经递质在平衡60 min后达到稳定状态[14]。
4 取样后管路和探针的清洁和保养探针的清洗和保存：取样结束后，立即取出探针，放入三蒸水中。
将探针与管路连接，用1 μL/min的速度冲洗过夜，充分排出管路和探针中存留的盐分后，取下探针，放入三蒸水中于 4 ℃冰箱保存，用于防止探针透析膜收缩。
若透析液体积和灌流液体积不一致，可能是探针被凝固的血液堵塞，可将探针置于胰蛋白液中，待可见物质从探针膜端剥落即取出。
管路在冲洗完毕后，自然晾干，密封出入口，置于低温条件保存，防止细菌滋生。
5 讨论微透析技术在神经科学、医药研究等领域已获得越来越广泛的应用[15-20]。
可以用于实时的神经递质变化的检测，不同于组织匀浆技术，不需要破坏机体的完整性，可维持在生理状态下神经递质检测。
微透析实验和其他很多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平[21]。
本文通过笔者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的技术要领。
在实验操作时应注意：（1）探针的选择要根据所检测部位的定位深度和神经递质分子量的大小，选择所需的规格；（2）探针埋置定位要准确，可根据脑图谱（AP、ML、DV值）要准确，微透析实验结束后要进行病理切片观察定位是否准确；（3）在取样前连接管路后，微注射器充满三蒸水后，进行灌流观察管路是否有漏液或堵塞，同时检测探针透析膜是否完好，是否可以使用；（4）插入探针前用三蒸水或人工脑脊液多次冲洗导管内，防止导管内有异物堵塞导管，损毁探针；（5）插入探针时，确定大鼠处于气体麻醉状态，插入探针时要特别注意不要损坏探针膜，延长探针的使用寿命和次数；（6）取样时要注意平衡时间和取样速度的确定，单胺类神经递质要在收集管中加入稳定剂；（7）取样成功的标准为平衡时间后，每隔10分钟连续收集三管透析液，能够在透析液中检测出目标神经递质的含量，并且几次检测的数据不具有统计学差异；（8）取样后要注意管路和探针的清洁和保养，连接管路和探针，三蒸水低速灌流过夜，排出管路和探针中残余的盐分；（9）清洁完毕后，探针置于三蒸水中4 ℃冰箱保存，管路自然晾干，密封开口，低温保存。
本文总结了笔者在进行微透析实验时，定位和取样以及取样后探针的清洁与保存的操作方法，为类似的脑区定位微透析取样实验提供方法依据。
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