微透析_高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定
1 仪器与试剂 岛津 LC- 10ADVP 高效液相色谱仪, RF - 10AXL荧光检
测器, 岛津色谱 工作 站, 分 析柱: BDSC18柱 ( H ype rsi,l 41 6 mm @25010 mm, 5 Lm ); 微透析设备与系 统: Beekeeper啮 齿类动 物容器与旋转接头系统 ( BAS, MD- 1575, USA), 微量注射泵 ( BAS, MD- 0250) , 微透析探针 ( BAS, MD- 2200, 2 mm 膜 ) , 微透析探针套管 ( BAS, MD- 2251), 三维立体定位仪 ( 第二军 医大学, 江湾 Ò型 C) 。邻苯 二甲醛 ( OPA, S igma ), 氨基 酸标 准品 ( 天冬氨酸、谷氨 酸、牛磺 酸、C - 氨 基丁 酸, S igm a), B 巯基乙醇 ( S igm a), 磷酸 二 氢钾 ( F luka), 甲 醇 (一 级色 谱 纯, 天津四友生物 医学技 术有 限公 司 ), 其它 试剂 均为 国产 分析 纯, 10% 的水合氯醛 (由浙 江省 中医 院提供 ), 所有 溶液 均用 超纯水 (M illipore)配制。 2 实验动物
精密量取已测 得天 门冬 氨酸、谷 氨酸、牛 磺酸、C - 氨基 丁酸含量的脑透 析液 1 mL 置于相 应的 离 心管 中, 精密 量取 15 LL, 分别精 密加 入上 述 4种 标准 品溶液, 按 方法 6处 理。 精密 量 取 25 LL, 注 入 液 相 色 谱 仪, 结 果 Asp 的 回 收 率: 9613% ( R SD = 11 18, n= 5) ; G lu的回收率为 9119% , ( RSD= 11 12, n= 5) ; Tau的 回收 率 为 9117% ( RSD = 1183, n = 5) ; GABA 的回收率为 961 4% ( RSD= 1134, n = 5)。 5 稳定性试验
[关键词 ] 高效液相色谱法; 微透析; 脑脊髓液
[ KEY W ORDS] H igh- power liqu id chrom atography; M icrod ia lysis; Cerebrospina l flu id
[ 中图分类号 ] R 363
[文献标识码 ] A
脑脊液中一 些游 离氨 基酸 的含 量测 定对 于某 些疾 病的 诊断和治疗有重要的意义。 近年来, 用高 效液相 色谱 - 荧光 检测法分析脑 组织和 脑脊 液中 的氨基 酸已 有不 少报 道 [ 1, 2] 。 但利用微透析技 术直 接从 动物 脑组 织特 定区 域内 抽取 透析 液, 并用高效液相色谱仪同时测 定其中 4种神 经递质 的氨基 酸: 天冬氨酸 ( Asp)、谷氨酸 ( G lu) 、牛磺酸 ( Tau) 和 C- 氨基 丁酸 ( GABA)的方法报道不多。本实验采 用微透析和 高效液 相相结合对体内氨基 酸的变化进 行测定, 为临 床应用 提供一 种有效的分析方法。
衍生反应 [ 6]是决 定氨 基酸 重现 性和 检测 效果 的重 要步
骤, 牛磺酸和 C- 氨基丁酸衍生的荧光产物极 其不稳定, 荧光 活性衰减很 快。因此, 从 衍生 剂加 入 的瞬 间开 始计 时, 轻轻 混匀 45 s, 静置 30 s时 进样, 即衍生 时间严 格控制 在 2 m in。 衍生剂的性质不稳 定, 应尽量避光、低 温 ( 0 - 4 e )保 存, 710 d后重新配制。由于 B - 巯基乙 醇容易 发生氧 化反应, 每 日使用前添加 10- 15 LL。
的含量。结果: 该体系可在 30 m in内对脑脊液 中 4种氨 基酸实现良 好的分离, 4种 氨基酸在 01625- 10 Lmol/L浓
度范围内与色谱峰面积线性关系良好, 保留时间分别是天门冬氨酸 41392 m in、谷氨酸 51592 m in、牛磺酸 131 625 m in、
C - 氨基丁酸 141833 m in。结论: 本方法准确、灵敏、方便、重复性好, 可用于微透析样品中氨基酸的含量测定。
雄性 SD大鼠以水合氯醛 ( 400 m g/kg)腹 腔麻醉, 固定在 立体 定 位 仪 上, 将 透 析 套 管 定 位 于 右 侧 纹 状 体 (前 囟 前 01 2 mm, 旁开 315 mm, 皮层下 512 mm )并 用小螺钉 固定。开 启透析灌流系统, 调节恒 流泵控制液流速 310 LL# m in- 1, 透 析探针与人工脑脊液灌 流系统 直接相 接。灌流平 衡 120 m in 后, 每 15 m in收 集 1管, 每管 30 LL, 共收 集 8管透 析液。收 集的透析液立即放 入 - 20 e 冰箱保存。 6 OPA 柱前衍生
准确提取 20 L L氨基酸 标准溶 液或微 透析样 品液, 再加 入 10 LL 0105 m ol/L 的 碳 酸 钠 缓 冲 液 和 10 LL 衍 生 试 剂 ( 5 LL OPA + 60 L L甲醇 + 90 L L B - 巯 基乙醇 + 11 2 mL四 硼酸钠, 混匀 45 s后静置反应 30 s。 7 色谱条件
箱 保 存, 人 工 脑 脊 液 ( mm ol) ( ASCF = NaC l 125, KC l 5, NaH 2 PO4 112, MgSO4 2, N aHCO3 2517, CaC l2 # H 2O 2, glucose 10, pH = 71 4)稀释成 5 Lmol/L的工作液。 4 标准溶液的配制
本实验采用微透析技术 将透析 探针埋 入动物 的脑中, 透 析探针可除去分子量大 于 30 000 的 分子 [ 4, 5] , 对周围 组织损 伤 很小, 取 样 量少, 并 且 多位 点 多时 点采 样 进行 动态 监 测。 样品不经预处理, 灌流速度稳定在 31 0 L L /m in可使回收率提 高。
液相分析采 用梯 度洗 脱, 缩短 分析 时间, 改 善峰 形 和提 高样品的检测灵敏 度。选用 KH 2 PO4 缓 冲液 配制流 动相, 其 浓度为 01 1 m ol/L, 如果浓度 过高会 破坏键 合相的 稳定性, 对 色谱柱的损 害较 大。另外, 缓 冲液 一 定要 用低 浓度 的, 临用 前现 配, 并 用 01 22 Lm 滤 膜 过 滤。水 用 超 纯 水 系 统 去 除 杂质。
采用梯度洗脱。 A相甲 醇: 磷 酸二氢钾 缓冲液 ( 011 mol/ L) = 35B65( pH = 616), B 相甲 醇: 磷 酸二 氢钾 缓 冲液 ( 0101 m ol/L) = 90B10, ( pH = 616 )。梯 度 洗 脱 时间 : 0 - 12 m in; B% : 0% - 40% ; 12101 - 20100 m in; B% : 100% - 100% ; 20101- 30 m in; B% 0- 0检测时, 激 发波长 ( Ex) = 357 nm, 发射波长 ( Em ) = 455 nm。
结果
1 4种氨基酸的分离
[ 收稿日期 ] 2006- 10- 09
[修 回日期 ] 2007- 02- 13
* [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( No. 30371789; No. 30672652); 浙江省自然科学基金资助项目 ( No. Z204424)
v 通讯作者 T e:l 0571- 86613711; E- m a i:l wanhaitong@ zjtcm. net
( 1浙江中医药大学脑血管病研究所, 浙江 杭州 310053; 2 浙江大 学第二附属医院, 浙江 杭州 310009)
[摘 要 ] 目的: 通过对大鼠脑透析液中氨基酸的含量测定, 为在体 氨基酸分 析建立方法。 方法: 利用微透
析技术抽取麻醉下大鼠 脑脊 液, 运用 OPA 柱前 衍生 法处 理样 品, 再用 高 效液 相二 元 梯度 洗脱 色 谱法, BDSC18柱 ( H ypersi,l 416 mm @2501 0 mm, 5 Lm ), 荧光检测脑脊液中 谷氨酸、天门冬氨酸、C- 氨基丁酸、牛磺酸等 4 种氨基酸
讨论
Байду номын сангаас
F ig 1 Standa rd chrom atogram. 1: A sp; 2: Glu; 3: Tau; 4: GA BA.
图 1 标准品色谱
F ig 2 M icrod ia lys is samp le chrom atogram. 1: Asp; 2: Glu; 3: Tau; 4: GABA.
# 1872#
在上述色谱 条件 下, 4 种 氨基 酸均 可 获得 很好 分 离 (图 1、2), 保留时间分别为: 天门冬 氨酸 41 392 m in、谷氨 酸 51 592 m in、牛磺酸 131625 m in、C - 氨基丁酸 141833 m in。
稳定。 6 大鼠脑脊液测定
取正常 SD大鼠 按透析 液制 备方 法制 备透 析液, 再 按上 述方法进行测定, 所得结果分 别为 A sp( 01920 ? 01 081) LmoL ( n= 5 ); G lu ( 21 386 ? 01420 ) Lm oL ( n = 5 ); Tau ( 51220 ? 01 685) Lm oL( n = 5); GABA ( 01688 ? 01073) LmoL( n= 5) 。
SD大鼠, 体重 300- 350 g, 雌雄不 拘, 购于浙江中 医药大 学动物实验 中心, 中 国 卫生 部认 证, Grade Ò, C ertificate No. 20 010 01 046。 3 人工脑脊液配制 [ 3]
取适量的标准品 配成约 10 Lmol/L的储备液, - 20 e 冰
图 2 微透析样品色谱
2 线性范围和相关系数 取不同浓度下的氨基酸 标准溶 液按 6 方法处 理, 立即进
样, 每次进样 25 LL, 室温下检测。其浓度 与峰面积呈 良好线 性关 系, 得 到的 回 归方 程 式: 天 门 冬氨 酸 Y= 1 058 363X + 159 879( r = 019991 ), 谷 氨 酸 Y= 1 694 940X + 256 189( r = 01 9991), 牛磺酸 Y= 1 000 472X + 36 203( r = 019995), C - 氨 基丁酸 Y= 1 051 753X - 159 153( r = 01 9993)。 3 精密度试验
微透析-高效液相色谱法测定米诺环素大鼠血液和脑内的药动学
微透析-高效液相色谱法测定米诺环素大鼠血液和脑内的药动学董文彬;程佳祎;陈爱瑛;郑高利【期刊名称】《中国临床药理学与治疗学》【年(卷),期】2012(17)6【摘要】目的:研究米诺环素在大鼠血液和脑内的药动学。
方法:采用微透析结合高效液相色谱技术,测定米诺环素大鼠血浆蛋白结合率;大鼠尾静脉注射米诺环素,测定给药后10h内不同时间点大鼠血液、海马CA1区中游离药物的浓度。
结果:米诺环素大鼠血浆蛋白结合率为82.08%,给药后迅速进入脑组织,在给药后3.83h左右浓度达到峰值,其后缓慢下降,脑组织的游离药物-时间曲线下面积(AUC0-10h)可达血液的62.42%。
结论:微透析结合高效液相色谱技术可以测定米诺环素的大鼠血浆蛋白结合率,并实现大鼠血液和脑组织中游离米诺环素浓度的动态监测。
结果表明米诺环素易于透过血脑屏障,且能长时间维持较高浓度,从而发挥其神经保护作用。
【总页数】5页(P654-658)【关键词】米诺环素;药动学;血浆蛋白结合率;微透析;高效液相色谱【作者】董文彬;程佳祎;陈爱瑛;郑高利【作者单位】浙江省医学科学院药物研究所;浙江中医药大学药学院【正文语种】中文【中图分类】R964;R917【相关文献】1.基于UPLC-TOF/MS和脑内微透析技术的异嗪皮啶在帕金森病模型大鼠脑内药动学研究 [J], 卢芳;范振群;张颖;周世慧;刘树民;唐波;杨婷婷2.微透析-高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定 [J], 韩进;万海同;别晓东;李金辉;张宇燕3.高效液相色谱法分析大鼠脑微透析液中的去甲肾上腺素 [J], 贺赛琳;岳云;张英民;郝建华;郭徽;盛志勇4.微透析和高效液相色谱法测定大鼠脑内天麻素及天麻苷元含量 [J], 吕允凤5.微柱高效液相色谱法测定大鼠脑微透析液中的乙酰胆碱和胆碱 [J], 贾兴元;吴安石;岳云;刘敬忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱法测定氨基酸
脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、仪器与试药1.1 仪器1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）1.2 药品与试剂16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。
脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。
批号：2013、2013、2013.乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。
2、方法与结果2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。
）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。
2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。
取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。
微透析_高效液相色谱法测定大鼠脑脊液中4种氨基酸的含量测定
本实验采用微透析技术 将透析 探针埋 入动物 的脑中, 透 析探针可除去分子量大 于 30 000 的 分子 [ 4, 5] , 对周围 组织损 伤 很小, 取 样 量少, 并 且 多位 点 多时 点采 样 进行 动态 监 测。 样品不经预处理, 灌流速度稳定在 31 0 L L /m in可使回收率提 高。
雄性 SD大鼠以水合氯醛 ( 400 m g/kg)腹 腔麻醉, 固定在 立体 定 位 仪 上, 将 透 析 套 管 定 位 于 右 侧 纹 状 体 (前 囟 前 01 2 mm, 旁开 315 mm, 皮层下 512 mm )并 用小螺钉 固定。开 启透析灌流系统, 调节恒 流泵控制液流速 310 LL# m in- 1, 透 析探针与人工脑脊液灌 流系统 直接相 接。灌流平 衡 120 m in 后, 每 15 m in收 集 1管, 每管 30 LL, 共收 集 8管透 析液。收 集的透析液立即放 入 - 20 e 冰箱保存。 6 OPA 柱前衍生
的含量。结果: 该体系可在 30 m in内对脑脊液 中 4种氨 基酸实现良 好的分离, 4种 氨基酸在 01625- 10 Lmol/L浓
度范围内与色谱峰面积线性关系良好, 保留时间分别是天门冬氨酸 41392 m in、谷氨酸 51592 m in、牛磺酸 131 625 m in、
C - 氨基丁酸 141833 m in。结论: 本方法准确、灵敏、方便、重复性好, 可用于微透析样品中氨基酸的含量测定。
液相分析采 用梯 度洗 脱, 缩短 分析 时间, 改 善峰 形 和提 高样品的检测灵敏 度。选用 KH 2 PO4 缓 冲液 配制流 动相, 其 浓度为 01 1 m ol/L, 如果浓度 过高会 破坏键 合相的 稳定性, 对 色谱柱的损 害较 大。另外, 缓 冲液 一 定要 用低 浓度 的, 临用 前现 配, 并 用 01 22 Lm 滤 膜 过 滤。水 用 超 纯 水 系 统 去 除 杂质。
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法
利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。
标签：微透析；透析液；立体定位；rACC脑区；大鼠前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。
已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。
微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。
该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。
目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。
在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。
但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。
笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。
1 定位1.1 微透析探针的选取微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。
本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。
EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。
高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量-精品文档
高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量复方氨基酸注射液是一种透明、无色或微黄色的澄明液体，适用于不能口服或经肠道补给营养，以及营养不能满足需要的患者。
复方氨基酸注射液具有促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。
氨基酸（Amino acid）是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性[1-4]。
蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。
酪氨酸是一种芳香族氨基酸，亦是20种用来合成蛋白质的蛋白氨基酸之一[5-11]。
色氨酸具有促进胃液及胰液产生的作用。
目前主要生产复方氨基酸注射液的厂家有上海长征富民金山制药XX公司、广东利泰制药XX公司、八峰药化宜昌有限责任公司、石家庄四药XX公司、西南药业XX 公司、湖南科伦制药XX公司、安徽丰原药业XX公司、广东科伦药业XX公司、广东利泰制药XX公司、广州百特侨光医疗用品XX公司等。
本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。
1 仪器与试药瑞士梅特勒-托利多MS精密天平（梅特勒-托利多中国公司）；SCQ-1020超声波清洗器（上海声彦超声仪器XX公司）；UltiMate3000 高效液相色谱仪（上海仪先仪器XX公司）；E2000制冷色谱柱温箱（上海子期实验设备XX公司）；UV2800紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器XX公司）；PHS-3C酸度检测仪（深圳市卡迪亚科技XX公司）；MP-TA-10L 超纯水器（成都优越科技XX公司）。
乙腈（济南汇丰达化工XX公司）、三乙胺（吴江市吉祥精细化工XX公司）、冰醋酸（济南汇丰达化工XX公司）、甲醇（吴江市吉祥精细化工XX公司）、醋酸钠（济南汇丰达化工XX公司）、磷酸二氢钠（吴江市吉祥精细化工XX 公司）、四氢呋喃（济南汇丰达化工XX公司）、磷酸（淄博丰仓化工XX公司）。
2 含量测定2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果[11]，确定色谱条件如下。
高效液相色谱-荧光检测法快速测定脊髓和脑内氨基酸
高效液相色谱-荧光检测法快速测定脊髓和脑内氨基酸王锦;沈霖霖;曹银祥;钱源;朱大年【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2005(020)005【摘要】目的建立快速测定脊髓和脑内氨基酸浓度的方法.方法通过邻苯二甲醛和β-巯基乙醇柱前衍生、反相高效液相色谱结合荧光(激发波长280 nm,发射波长340 nm)检测氨基酸浓度.用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值6.00～6.25)和甲醇(46%)混合液(加入四氢呋喃2%)作流动相,流速为1 ml/min.结果在0.1～40.0μmol/L范围内,氨基酸浓度与相对峰面积之间的相关系数(r)均值为0.999 2,日内和日间变异系数(CV)分别为2.41%～5.23%、3.51%～6.48%,平均回收率为90.13%～98.47%.结论本法灵敏度高、快速、简便易行,可用于脊髓和脑内氨基酸测定.【总页数】4页(P424-427)【作者】王锦;沈霖霖;曹银祥;钱源;朱大年【作者单位】复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海,200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海,200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海,200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海,200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】R446.1【相关文献】1.高效液相色谱-荧光检测法快速测定植物油中的α-生育酚 [J], 寇立娟;李兰晓;王明林;胥洪2.高效液相色谱荧光检测法快速测定天然生育酚中痕量苯并[a]芘 [J], 董新艳;杨亦文3.基于涡流色谱技术的在线固相萃取/高效液相色谱-荧光检测法结合在线稀释快速测定牛奶中5种氟喹诺酮抗生素残留 [J], 张艳海;金燕4.高效液相色谱-荧光检测法快速测定血清中的色氨酸 [J], 王清平;唐爱国5.多环芳烃分子印迹柱-高效液相色谱荧光检测法快速测定烤肉中15种多环芳烃[J], 阳文武;谭顺中;郭娅;周浓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱的使用及氨基酸标样的分析
三、流动相的选择
• • • • • 采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配
四、高效液相色谱仪的基本结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离 系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成，其 基本结构如下图：高效液相色谱的特点与基本结 构.ppt
石油醚 色素 碳酸钙颗粒 玻璃柱
二、定义
色谱法：利用组分在两相之间分配系数不同 而进行分离的技术
移动相：携带样品流过整个系统的流体
固定相：静止不动的一相，通常为色谱柱固定
液
反相液相色谱
流动相极性大于固定相极性 能溶于水/有机混合物的中性或非离子 化合物
正相液相色谱
流动相极性小于固定相极性
不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异 构体混合物和制备HPLC
二、LC-10AVP液相色谱仪键盘操作
三、氨基酸标样的分析
一、实验目的 （1）熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理 和操作程序。 （2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。
二、实验原理 氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在 254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高 效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保 留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法 是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方 程式如下图所示：
PITC
PTC
• 三、实验仪器和试剂
1、仪器：高效液相色谱仪（带紫外检测器）。
2、材料 氨基酸标样 3、试剂：
衍生液： 异硫氰酸苯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1 正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠 以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为 分析醇。
四、实验步骤 1、柱前衍生步骤： （1）将200ul衍生液加入200ul氨基酸标样或样品中， 震荡使混合均匀，室温放置1小时。 （2）反应液中加入400ul正己烷，充分震荡后放置使 分层。 （3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。 （4）取滤液5ul注入HPLC。
HPLC测定脑组织和脑脊液中4种氨基酸类神经递质含量的方法改良研究
HPLC测定脑组织和脑脊液中4种氨基酸类神经递质含量的方法改良研究王炜;刘朝;江卫国;王式平;何善述【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】1999(028)002【摘要】谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等神经递质的代谢异常是诱发多种神经系统疾病的因素之一.由于神经递质在脑内的含量很低,改良建立了一种用HPLC 荧光检测Glu、GABA等4种神经递质的方法,以高丝氨酸为内标,流动相为磷酸缓冲液和甲醇,梯度洗脱20min,荧光检测.分离效果及线性关系良好,Glu、GABA的相关系数分别为0.9969、0.9996;精密度CV批内3.4 %,批间5.6 %;其最小检测限分别为3.3 pmol、1.6 pmol.【总页数】2页(P92-93)【作者】王炜;刘朝;江卫国;王式平;何善述【作者单位】同济医科大学基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;同济医科大学附属协和医院中心实验室,武汉,430022;同济医科大学基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;同济医科大学基础医学院生物化学教研室,武汉,430030;同济医科大学基础医学院生物化学教研室,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】Q592.5;R322.8【相关文献】1.AQC柱前衍生RP-HPLC荧光法测定颅脑损伤患者脑脊液中氨基酸类神经递质[J], 陈为;柯雪红;杨小催2.OPA柱前衍生RP-HPLC-FLD测定小鼠脑组织中6种氨基酸类神经递质 [J], 黄冰琳3.大鼠脑组织中氨基酸类神经递质的rP—HPLC—UV柱前衍生定？… [J], 祁艳斌;张纬4.RP-HPLC法测定大鼠脑组织及脑脊液中四种氨基酸类神经递质的含量 [J], 周卿;代广会;左巨波;尚京川5.荧光高效液相色谱法测定三种失眠模型大鼠脑组织氨基酸类神经递质的含量 [J], 涂星;郜红利;卢映;吴俊洪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
氨基酸类神经递质含量测定
❖ 方法2【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】
美国 waters 2695 高效液相色谱仪、UV检测器及 色谱数据处理系统。
色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4 .6×200nm， 5μm)；流动相A 为醋酸钠缓冲液，B为乙睛-水。柱 温：28℃，进样量20μL，采用外标法定量。
Agilent 1100 高效液相色谱仪；G1321A荧光检测 器
色谱条件：Zorbax Eclipse AAA C18柱色谱柱； 75×4. 6 mm，3. 5μm；流动相A为NaH2PO4·H2O缓 冲液；流动相B为乙腈/甲醇/水，梯度洗脱。
DAD检测波长：紫外波长338 nm；FLD检测波 长：激发波长340 nm，发射波长450 nm。
一、样品处理
❖ 方法1【高效液相色谱法检测小鼠脑组织中氨基酸类神经递质 】 脑组织称重，加入 9倍体积的甲醇/水，冰浴匀
浆；离心，上清液低温保存。 衍生化反应：小脑组织液加入乙睛，混匀离心，
取上清液加入 NaHCO3和2,4 -二硝基氟苯，混匀， 暗中衍生 (水浴 65 ℃ )，进样。
❖ 方法2【反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质】
色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX C18柱 (4.6 mm× 150mm，5μm)，采用梯度洗脱。流动相 A为甲醇，流动相B为醋酸钠缓冲液。柱温30℃，进 样量20μL。
荧光检测波长：激发光波长为 340 nm，发射光 波长为 450 nm。
0 . 625-5μmol /L浓度范围内线性关系良好
荧光检测波长：激发波长为340 nm，发射波 长为 455 nm。
在 0.5-40μmol/L 浓度范围有较好的线性关系
高效液相色谱_电化学法测定大鼠血液和脑组织中单胺类物质的含量
第25卷第2期2006年3月 分析测试学报FENXI CESH I X UEBAO(J ournal of Ins tru m en talAnal ys i s)V ol 25No 290~92高效液相色谱/电化学法测定大鼠血液和脑组织中单胺类物质的含量谭炳炎1,郑 琳1,冯 翔2(1.中山大学 公共卫生学院 中心实验室,广东 广州 510080;2.中山大学 公共卫生学院 营养学系,广东 广州 510080)摘 要:建立了高效液相色谱/电化学检测法测定大鼠脑组织和血液中单胺递质及其代谢产物的方法。
能同时测定去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、3,4-二羟基苯乙酸(DO PAC)、多巴胺(DA)、高香草酸(HAV)、5-羟色胺(5-HT),并能和内标3,4-二羟卞胺(DHBA)分离良好。
本方法快速、简便,回收率为92%~105%,线性范围2 8~680ng/mL,检出限为0 05ng(S/N=3)。
本方法已应用在服用中药的大鼠下丘脑组织及血液的测定中,数据显示,本法能满足测定要求。
关键词:高效液相色谱;电化学检测;单胺类神经递质中图分类号:O657 1 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2006)02-0090-03D eter m i nati on o fM onoa m i ne T rans m itters i n R at Blood and Brai n T issues byH i gh Perf or m ance L i qu i d Chro m atographyTAN B ing-yan1,Z H E NG Lin1,FE NG X iang2(1.Central L aboratory,Schoo l o f Pub lic H ealth,Sun Y at-sen U n i versity,G uangzhou 510089,China;2.D epart m ent o fNutritiona l Sc i ences,School o f Publi c H ea lth,Sun Y a t-sen U n i versity,G uangzhou 510089,Ch i na) Abstrac:t A m ethod was developed to deter m i n e m onoa m ine trans m itters and their m etabo lites in rat blood and brain tissues by h i g h perfor m ance li q u i d chro m atog raphy w ith electroche m i c al detection.No r-ep i n ephri n e(NE),ep i n rphri n e(E),3,4-d i h ydr oxypheny lacetic acid(DOPAC),dopa m ine hydrochlo-ride(DA),ho m ovan illi c ac i d(HVA),and5-hydr oxytrypta m i n e(5-HT)cou l d be deter m i n ed si m ulta-neously and disti n ctly separated fro m i n ter nal standar d(3,4-dihydroxybenzyla m ine,D H BA)by th is m ethod.The recoveries of these co mpounds w ere bet w een92%and105%and the li n ear range w as2 8-680ng/m L.The detecti o n li m itw as0 05ng(S/N=3).This m ethod was app lied to deter m i n i n gt h e m onoa m i n es i n hypothala mus tissues of rats upon taking traditional Ch i n ese m ed ici n e,and satisfac-to r y resu lts w ere achieved.Key words:H i g h perfor m ance li q u i d chr o m atography;E lectroche m i c al detecti o n;M onoa m ines单胺类神经递质包括去甲肾上腺素(NE),肾上腺素(E),多巴胺(DA),5-羟色胺(5-HT)等物质。