江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中Ⅲ型羊毛硫肽的异源表达
两种水生动物抗菌肽的原核表达与活性分析(pdf 6页)
1. 1. 3 缓冲液体系 缓冲液体系的种类和配方见表 1。
表 1 缓冲体系的配方
T ab le 1 Th e p rescription of buffer
种生物细 胞特定基因 编码, 经外 界 条件诱导产生的一 类具有广谱 抗细菌、真菌、病毒、原 虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽 [1 2]。抗菌肽广 泛 地存在于细菌、植物、昆虫、哺乳动物、两栖动物、鱼类、 软体动物以及甲壳类动物中, 其相对分子质量小, 由 12 ~ 100 个氨基酸组成; 热稳定性高, 一些肽类在 100 加 热 10 ~ 15 m in 仍能保持其一定的活性; 对较大的离 子 强度和 pH 值均具有较强的耐受性; 部分抗菌肽能够耐 胰蛋白酶或胃蛋白酶水解。抗菌肽是天然免疫防御系 统的一个重要组成部分被称为 第二防御体系 ! [ 3]。
2011, 31( 2)
舒 梅 等: 两 种水生动物抗菌肽的原核表达及活性分析
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单体, 并对融合蛋白和抗菌肽单体进行活性分析, 研究 E. coli DH 5 和 E. coli Rosetta为本实验室保存。
其抗菌活性, 发 现 GST CEC1、GST Y 18 和抗菌 肽单 体 1. 1. 2 试 剂 GST B ind Resin 购 自 Novagen 公 司;
目前, 抗菌肽可通过 3种途径获得: ( 1 ) 从生物体 内提取纯化; ( 2) 化学人工合成; ( 3) 构建基因工程抗 菌肽菌株。生物体内含量非常低, 提取时操作复杂, 产 率低; 而化学合 成成本太高, 副 产物多, 都不能满 足实 际需求, 利用基 因工程成本低, 操作相 对简单, 因 此能 实现大规模生产抗菌肽。本研究成功表达了两种水生 动物抗菌肽的 融合蛋白, 利 用凝血酶酶 切获得抗 菌肽
博士学位论文-中国科学院青岛生物能源与过程研究所机构知识库
In this research, two chaperones (protein disulphide isomerase, pdi1 and HSP70 family chaperones, bip1) were overexpressed and a polyketide synthase (PKS65172) was knocked out respectively in QM6a, the results showed that both methods could improve the cellulase production of QM6a to a certain extent. The differences of secondary metabolites between PKS65172 gene knockout strain and wild-type QM6a were also analyzed, there are many important mechanisms are worthy of being studied.
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丝状真菌遗传转化系统研究进展_李娟
第28卷第4期江西农业大学学报Vol.28,No.4 2006年8月Acta Agriculturae Universitatis J iangxiensis Aug.,2006文章编号:1000-2286(2006)04-0516-05丝状真菌遗传转化系统研究进展李娟,杨金奎,梁连铭,张克勤3(云南大学生物资源保护与利用重点实验室,云南昆明650091)摘要:近年来,丝状真菌的分子生物学研究发展非常迅速,尤其是丝状真菌遗传转化研究取得了长足的进展。
对丝状真菌遗传转化系统的最新研究进展进行综述,主要包括丝状真菌的转化方法、选择标记、转化系统的应用等。
关键词:丝状真菌;转化方法;选择标记中图分类号:Q949.32 文献标识码:AAdvance i n the Research on Geneti c Transfor mati onSyste m of Fil amentous FungiL I Juan,Y ANG J in-kui,L I A NG L ian-m ing,ZHANG Ke-qin3(Laborat ory for Conservati on and U tilizati on of B i o-res ources,Yunnan University,Kunm ing650091,China) Abstract:Fila ment ous fungi are a kind of eukaryoteswhich exist universally in nature and are of econom i2 cal significance.The latest p r ogresses in the research on genetic transf or mati on syste m p lay an i m portant r ole in understanding fila ment ous fungi.So me transf or mati on methods,selective markers,and the app licati on of transf or mati on syste m in the field of research on fila ment ous fungi are revie wed in this paper.Key words:fila ment ous fungi;transf or mati on method;selective marker1 概 述丝状真菌作为低等的真核生物,对人类生命活动的各个方面均产生了深远的影响,为了控制真菌对人类不利的一面,充分利用其有益的特性服务于人类,就必须深入的了解其生理、遗传以及分子生物学方面的信息,并通过分子生物学手段对其进行有效改造。
提高平末端连接效率的研究
;<=%-62%：2B 1< 1CDEFB67B BE 1CDFEG0 B=0 0881H107HI E8 5196B1E7 F06HB1E7，0<D0H1655I 8EF JE17179 E8 K547B ( 07L0L M-, N=1H= 1< 471G0FO <65 6DD51H6B0L，=EN0G0F，N1B= 5EN0F 0881H107HIP 27 E4F <B4LI，/0 LF6N 6 HE7H54<1E7 B=6B B=0 CE5 ( F6B1E E8 G0HBEF 67L 17<0FB、 BL B1C0 E8 5196B1E7 F06HB1E7 0BHP ,55 H67 1785407H0 B=0 0881H107HI E8 5196B1E7，<E N0 <=E45L B=17Q E8 E8 5196B1E7 F06HB1E7、 B=0<0 86HBEF< BE90B=0FP >#( ?)-’=：>196B1E7 E8 K547B ( 07L0L M-,；?881H107HI E8 5196B1E7
提高平末端连接效率的研究
作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 引用次数： 张伟， 艾秀莲， 王玮， 王志方， 崔春生， 李晨华， 谢玉清 新疆农科院微生物所,新疆乌鲁木齐,830000 新疆农业科学 XINJIANG AGRICULTURAL SCIENCES 2002，39(5) 1次
细菌异源表达抗菌肽的研究进展
细菌异源表达抗菌肽的研究进展
吕晓萌;胡彤;俞婷;崔艳华
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2014(000)005
【摘要】抗菌肽是一类从动植物、微生物体内分离得到的阳离子小分子量肽,具有天然的抗菌活性.它作用迅速,广谱,不易产生耐药性,具有重要的应用价值,近年来成为研究热点.普遍认为异源表达是生产大量抗菌肽的最有效方法.大肠杆菌作为经典的表达宿主,具有生长速度快、遗传背景清晰、有大量可利用的商业表达载体、易操作等优势,现已成为抗菌肽表达的首选宿主.乳酸菌作为世界公认安全的食品级微生物,近年来广泛用于抗菌肽的异源表达.着重阐述了抗菌肽在大肠杆菌、乳酸菌中重组表达的研究进展.
【总页数】8页(P37-44)
【作者】吕晓萌;胡彤;俞婷;崔艳华
【作者单位】哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150090;哈尔滨工业大学食品科学与工程学院,哈尔滨150090
【正文语种】中文
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3.水产动物抗菌肽基因异源表达研究进展 [J], 单晓枫;吴同垒;王贵生;钱爱东
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蚕类抗菌肽异源表达与应用研究进展
关 键 词 抗菌肽 异源表达 活性 应 用
在现 代 医学 发展 中 ， 生 素 以其 极佳 的抗 菌作用 在 细 菌性 疾 病 治疗 过 程 中 占据 了 主要 地 抗
位， 它为人 们治疗 微 生物感 染疾 病 提供 了新 的方 向， 为人类健 康事 业做 出 了 巨大 的贡 献 。但 Ｊ
摘Leabharlann 要 蚕 类 抗 茵肽 作 为 昆 虫 抗 茵肽 之 一 ， 有 分 子 量 小 、 稳 定 性 好 、 茵谱 广 等优 点 ， 新 具 热 抗 是
世 纪抗 生素 最理 想 的替 代 药物 。 目前 已 经成 功鉴 定 ４ Ｏ个 家蚕 抗 茵肽 基 因 ， 包括 Ｃ ｃｏ ｉｓ Ｅ ｂ — ｅｒｐｎ ， ｎ ｏ
Ａｔ ｃ ｓＭｏｉ ｎ 、 ｌｖ ｒ ｓ 和 Ｌ ｂ ｅｎ ｔ ｉ 、 ｒ ｉｓ Ｇ ｏ ｅｉ 、 ａｎ ｃ ｎ ｅ ｏ ｉｓ等 家 族 成 员 。２ ０ ０ ８年 Ｗｅ ｎ等［］ 行 了家 蚕 Ｄ 一 １进 ０ ｅ
＊
资助 项 目： 庆 市 自然 科 学 基 金 重 点 项 目（ 号 Ｃ Ｔ ２０ Ｂ ０ ８ ， 南 大 学 博 士 基 金 项 目 （ 号 重 编 Ｓ Ｃ，０ ８ Ａ１０ ） 西 编
１ 蚕 类 抗 菌 肽 的家 族 分 类
家蚕 是重要 的经济 昆虫 ，０ ６年 中国蚕 丝 业 生产 价 值达 到 １ ７ ２０ ． ７千万 美 元 ［ 。由 于家 蚕 ７ ］ 容 易 饲 养 ， 利 用 的 突变 体 多 等 特点 使 之成 为继 果 蝇 之 后 的昆 虫 遗 传 学 研究 的模 式 生 物。 可 ２ ０ 年 家蚕基 因组 序列 测序 已 经完成 ［ ；０ ７年 ， ０３ ８ ２０ 高精度 的家 蚕基 因组 数据得 以诞 生 ， 夏庆友 等人 预测其 基 因数 目大 约为 １ ， ２ ４ ６ ３个 。２ ０ ０ ６年 Ｔｉｇａ Ｃ ｅ ｇ等人 ［ 利用 家 蚕基 因数 据库 ｎ ｃｉ ｈ ｎ ９ 本地 Ｂ ａｔ鉴 定 了 ３ ｌｓ ５个 与其 它 昆虫 抗 菌 肽 相 似 的 氨基 酸 序 列 ： 括 Ｃ ｃｏ ｉｓ Ｅ ｂ ｃｎ 、 包 ｅｒ ｐｎ 、 ｎ ｏ ｉｓ
抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究
抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究引言：抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽类物质，这些肽在自然界中广泛存在于动植物和一些微生物中。
由于其天然来源、低毒性、高效率等特点，抗菌肽被广泛应用于食品、医药、农业等领域。
然而，抗菌肽的大规模生产受到了许多因素的限制，如成本、稳定性等。
因此，酵母异源表达系统成为抗菌肽及其他功能蛋白高效率制备的理想平台。
本文将介绍抗菌肽类和酶类酵母异源表达的研究现状和挑战。
一、抗菌肽的酵母异源表达1.1 酵母异源表达系统简介酵母是一类简单的真核生物，其异源表达系统具有优异的蛋白质表达性能和机制研究条件。
常用的酵母包括酿酒酵母(酮酸酸酯酵母)，毕赤酵母等。
酿酒酵母是一种广泛应用于工业生产中的真菌，具有优秀的产酒性能和设备基础。
因此，酿酒酵母常被选为抗菌肽异源表达的宿主菌株。
1.2 抗菌肽的酵母异源表达策略抗菌肽异源表达的主要策略分为两类：短肽策略和全长策略。
短肽策略通过合成或克隆抗菌肽编码基因的短序列至酵母基因中，将其表达于酵母细胞。
全长策略则采用克隆含有完整抗菌肽基因的表达载体，将其转化至酵母中。
两种策略各有优缺点，在不同情况下可根据需要选择适宜的表达策略。
1.3 抗菌肽异源表达困难与解决抗菌肽的异源表达常常面临以下困难：剧毒性、导入异源抗菌肽基因时的细胞毒性及失活等。
为解决这些问题，研究者采用了许多策略，如信号肽重组、构建多基因拷贝操控系统、优化培养条件等。
这些改进方案显著提高了抗菌肽异源表达的成功率和产量。
二、酶类酵母异源表达的研究2.1 酶类在工业生产中的重要性酶类是一类在化学反应中起催化作用的生物催化剂，具有高效、特异性、低成本等特点。
在日常生活和工业生产中，酶类广泛应用于食品、制药、能源等领域。
因此，酵母异源表达酶类的研究具有重要的应用价值。
2.2 酵母异源表达酶类的策略酵母是一类优质的酶源，其异源表达系统具有高效稳定的表达性能。
常用的酵母异源表达构建策略包括直接表达、表面展示、分泌表达等。
变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建_白亭丽1俞燕飞1徐钟1陶美凤1_2
第33卷第1期2014年 1月华 中 农 业 大 学 学 报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l .33 N o .1J a n .2014,1~6收稿日期:2013-05-21基金项目:国家自然科学基金项目(31170084)白亭丽,硕士研究生.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :b a i t i n gl i @g m a i l .c o m 通信作者:陶美凤,博士,研究员.研究方向:链霉菌分子生物学.E -m a i l :t a o _m e i f e n g @s jt u .e d u .c n 变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建白亭丽1 俞燕飞1 徐 钟1 陶美凤1,21.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉430070;2.上海交通大学微生物代谢国家重点实验室,上海200030摘要 以变铅青链霉菌T K 24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(C D A )㊁放线紫红素(A C T )和十一烷基灵菌红素(R E D )这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a ,构建得到变铅青链霉菌菌株S B T 5㊂将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入S B T 5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株T K 24只产微量蓝色抗生素;S B T 5接合子的A C T 产量也显著高于导入了额外a c t 基因簇拷贝的出发菌株接合子㊂S B T 5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选㊂关键词 变铅青链霉菌;异源表达宿主;次级代谢产物;抗生素生物合成基因簇;基因敲除;a fs R S c l a 中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2014)01-0001-06天蓝色链霉菌(S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r )是链霉菌分化发育和遗传学研究的模式菌株,可以产生色素类抗生素放线紫红素(A C T ,中性及偏碱性下呈蓝色)㊁十一烷基灵菌红素(R E D ,中性及偏碱性下呈红色)以及抗细菌抗生素钙依赖抗生素(C D A ),天蓝色链霉菌也常被作为宿主菌用于次级代谢基因簇的异源表达[1]㊂天蓝色链霉菌对甲基化D N A 具有限制作用,妨碍了它作为宿主的广泛应用㊂变铅青链霉菌(S t r e p t o m yc e s l i v id a n s )是天蓝色链霉菌近缘种,对甲基化D N A 没有限制作用,常被用作单基因或基因簇异源表达的宿主[2]㊂野生型变铅青链霉菌T K 24的基因组含有A C T ㊁R E D 和C D A 这3种抗生素的生物合成基因簇,对外源基因簇的表达筛选可能会造成干扰;这些基因簇只在特定条件下才会表达,表明该菌株合成次级代谢产物的能力较低㊂根据变铅青链霉菌的这些特点,本研究拟敲除这些内源基因簇,同时加入一个全局性调控基因a f s R S ,用以激活次级代谢基因簇,旨在构建适用于次级代谢产物基因簇异源表达和筛选的高效宿主菌㊂1 材料与方法1.1 菌株及质粒大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i )D H 5α为克隆宿主[3];大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002为大肠杆菌-链霉菌属间接合转移供体菌[4]㊂蕈状芽胞杆菌(B a -c i l l u sm yc o ide s )为钙依赖抗生素(C D A )生物活性测定的指示菌[5]㊂变铅青链霉菌T K 24[6]为野生型链霉菌,出发菌株㊂天蓝色链霉菌K 7为M 145衍生菌株,由徐钟构建(未发表),在其C D A 生物合成基因簇(c d a )的下游有T n 5微型转座子(m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ)插入,但C D A 的合成不受影响,m i n i -T n 5-a a c (3)Ⅳ序列中含有阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ以及大肠杆菌质粒p U C 18的复制子,本研究利用K 7菌株的这些特点克隆c d a 基因簇部分序列,并用于构建c d a 基因置换质粒㊂质粒p S E T 152[7]包含接合转移起始位点o r i T R K 2㊁阿泊拉霉素抗性基因a a c (3)Ⅳ㊁放线菌噬菌体F C 31整合位点a t t P 以及整合酶基因i n t ㊂p MM 1为p S E T 152衍生质粒,含有放线紫红素生物合成基因簇,由王业民构建(未发表)㊂p H L 737为放线紫红素生物合成基因簇敲除载体,由徐钟构建(未发表);p H L Y 32为十一烷基灵菌红素基因簇敲除载体,由俞燕飞构建(未发表);pH L 851携带来自棒状链霉菌的全局性调控基因a fs R S c l a [8]㊂1.2 引物及试剂本研究应用的引物序列如表1,由上海生工生物技术有限公司合成㊂网络出版时间：2013-12-13 14:26网络出版地址：/kcms/detail/42.1181.S.20131213.1426.001.html华中农业大学学报第33卷表1 本研究所涉及引物及其用途T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y a n d i t s a p pl i c a t i o n 名称N a m e 序列S e qu e n c e 用途A p pl i c a t i o n o r i T -FG G A T C C G G T T T C A T C A G C C A T C C G 扩增o r i T 片段A m pl i f i c a t i o no f o r i T o r i T -R A G A T C T T G C C A A A G G G T T C G T G T A GK 7-B K FT G C T G C T G C T C A T C C A C C A C A T C G 筛选含c d a 序列的p H L T 2S c r e e n i n g fo r p H L T 2w h i c h c o n t a i n i n g c d a s e qu e n c e K 7-B K RC G T C A T C C G G G T C G C G T T C AK 7-L N -FG A G C C T C C G T C C A C C G T C G T T T K 7-L N -RC C A G C T T C C T G T T C G G C G T C AK 7-L e f t -F G C A G G T C G G T G A G C A C G A A G G TK 7-L e f t -R T G G T G G A T G A G C A G C A G C A G G A C s jh C h e k 1F C G A C T G G C T G G A C G T G C T G G A A 筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 1)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e p l a c e m e n tm u t a n t (P C R 1)s jh C h e k 1R A C G A C G A C A T G C G G G A G G T G C Tt n -7-2047-F G G G G A T A A C G C A G G A A A G A A筛选c d a 基因簇中断菌株(P C R 2)S c r e e n i n g fo r c d a g e n e c l u s t e r r e pl a c e m e n tm u t a n t (P C R 2) 限制性内切酶和碱性磷酸酶购自F e r m e n t a s 公司;连接酶S o l u t i o n Ⅰ㊁D N A 聚合酶r T a q 等试剂购自T a K a R a 公司;琼脂糖回收试剂盒购自OM E -G A 公司;高保真D N A 聚合酶K O D p l u s 购自T O Y O B O 公司;抗生素购自S i g m a 公司;其余试剂均购自国药集团和O x o i d 公司㊂1.3 培养基L B 培养基用于培养大肠杆菌[8]㊂2ˑY T 培养基[9]用于接合转移时链霉菌孢子的热激处理㊂M S 培养基用于链霉菌的培养㊁产孢和接合转移[10]㊂营养琼脂培养基用于生测涂布培养蕈状芽胞杆菌[11]㊂S MM S 培养基用于链霉菌产素观察[12]㊂N A 培养基用于链霉菌固体发酵产抗生素[13]㊂1.4 DNA 的抽提、转化及克隆大肠杆菌质粒D N A 和链霉菌总D N A 抽提参照标准操作方法[9-10]㊂质粒酶切和连接方法参照酶的使用说明书㊂D N A 片段的回收参照琼脂糖回收试剂盒的使用说明书㊂D N A 片段的P C R 扩增参见文献[9]㊂大肠杆菌转化参照标准钙转方法[9]㊂D N A 序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定㊂1.5 大肠杆菌和链霉菌属间接合转移大肠杆菌和链霉菌属间接合转移参照文献[10]进行,将待转穿梭质粒转化到大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,挑单克隆转化子于L B 中活化过夜;活化后按1ʒ100(V /V )的比例转接到新鲜L B 中培养到D 600n m =0.4~0.6,收集菌体,用新鲜L B 洗涤2次,0.1倍体积L B 悬浮备用㊂同时将新鲜链霉菌孢子悬浮于2ˑY T 培养基中,50ħ水浴10m i n,自然冷却㊂1ʒ1(V /V )混合大肠杆菌和孢子,涂布在M S 无抗平板上,30ħ培养14~18h ,用抗生素和三甲氧苄啶覆盖筛选接合转移子㊂1.6 cda 基因簇敲除质粒的构建从天蓝色链霉菌K 7菌株中克隆c d a 生物合成基因簇的部分序列,然后用来自p H L 851的a f s R -S c l a 替换c d a 基因簇内部分片段,获得c d a 基因簇敲除质粒㊂具体构建过程如下:1)c d a 基因簇部分序列的克隆㊂抽提K 7菌株的总D N A ,S a u 3A I 部分酶切,回收大约20k b 的片段,自连后转化大肠杆菌D H 5α,获得具有阿泊拉霉素抗性㊁含有完整的m i n i -T n 5-a a c (3)I V 微型转座子的克隆,最后从这些克隆中P C R 筛选到含有较长c d a 基因簇序列的克隆,命名为p H L T 2㊂2)a f s R S c l a D N A 片段的结构改造㊂用P C R 方法从p S E T 152上扩增含o r i T R K 2的D N A 片段,用B a m HⅠ和B gl Ⅱ双酶切P C R 产物,插入到pH L 851上a f s R S c l a 下游的B a m HⅠ位点,得到质粒p H L T 1㊂3)c d a 基因簇敲除质粒的构建㊂用P s t I 和E c o RⅠ双酶切p H L T 1,回收含有a f s R S c l a -o r i T 的4685b p 片段,与P s t Ⅰ和E c o RⅠ双酶切p H L T 2得到的约14k b 片段连接,得到p H L T 3,再用K pn Ⅰ酶切p H L T 3,自连以抹掉过长的一段基因组D N A ,得到p H L T 4,在该质粒中用全局性正调控基因a f s R S c l a 替换掉了7.1k b 的c d a 基因簇部分D N A 片段,可用作c d a 基因簇基因置换质粒㊂1.7 抗生素基因簇敲除突变菌株的筛选通过同源重组删除基因簇的部分序列来失活抗生素合成基因簇,为便于今后菌株的应用,不采用抗生素抗性基因来替换待中断的基因,因此,基因中断菌株没有抗生素抗性,筛选必须分为两步进行㊂首先,接合转移得到整合了中断载体的链霉菌,P C R筛选并且验证单交换;其次,正确的单交菌株在抗性2第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建 M S 平板培养至产孢,孢子稀释涂布到无抗的M S平板上培养,用影印的方法将长好的菌落转印到抗生素平板上培养,对照2个平板挑选无抗性的克隆,然后抽提总D N A ,通过P C R 筛选双交换突变株㊂1.8 抗生素生物活性测定将待测链霉菌接种到N A 培养基上,30ħ培养7d 进行固体发酵㊂指示菌芽胞杆菌于L B 培养基中37ħ㊁200r /m i n 活化过夜,然后转接培养至D 600n m =0.4~0.6,取200μL 培养物均匀涂布到营养琼脂平板上,接着用打孔器取相同大小的链霉菌发酵菌块放置到上述营养琼脂平板上,37ħ培养12~16h 后观察抑菌圈㊂2 结果与分析2.1 cda 基因簇敲除1)c d a 基因簇敲除质粒p H L T 4的构建㊂从天蓝色链霉菌k 7菌株的总D N A 中克隆得到p H L T 2,P C R 验证m i n i -T n 5-a a c (3)I V 一侧含有约14k b 的c d a 基因簇部分序列,在此基础上构建p H L T 4(图1)㊂p H L T 4与p H L T 2相比:c d a 基因簇D N A 序列中从P s t Ⅰ到E c o R Ⅰ位点的7.1k b 部分片段被a f s R S c l a -o r i T 所取代;且p H L T 4中a f s R S c l a -o r i T 两侧可用于同源交换的染色体D N A 片段分别为4544和2312b p,可用于c d a 基因簇的基因置换㊂图1 c d a 生物合成基因簇基因置换质粒p H L T 4的构建流程F i g .1 C o n s t r u c t i o no f p H L T 4,t h e c d a g e n ec l u s t e r g e n e r e p l a c e m e n t pl a s m i d 3华中农业大学学报第33卷2)c d a 基因簇敲除菌株的构建㊂将p H L T 4接合转移到变铅青链霉菌T K 24中,筛选阿泊拉霉素抗性(A p r R)的接合转移子,用o r i T R K 2特异性引物进行P C R 验证菌株基因型为单交换菌株㊂从A pr R的单交换菌株后代中通过影印筛选得到阿泊拉霉素敏感(A p r S )菌株,设计2个P C R 反应从A pr S菌株中筛选㊁验证双交换菌株,双交换只有P C R 1可以有阳性条带产生,野生型没有阳性条带,而单交换则2个P C R 反应都有阳性条带(图2)㊂图2中5㊁13和14号为正确的双交换菌株,命名为S B T 2㊂与T K 24出发菌株相比,S B T 2明显产生更多的蓝色色素(图3)㊂ M :1k b 标准(对照)1k b m a r k e r ;WT :野生型S .l i v i d a n sS .l i v i d a n s w i d e t y pe ;2~16:来源于p H L T 4接合转移子的衍生菌株S t r a i n s d e r i v e df r o ma nA p r R p H L T 4e x c o n j u ga n t .图2 c d a 基因簇置换菌株的P C R 筛选与鉴定F i g .2 P C Rs c r e e n i n g an dc o n f i r m a t i o no f t h e c d a g e n ec l u s t e r r e pl a c e m e n t s t r a i n s 2.2 放线紫红素和十一烷基灵菌红素基因簇的基因敲除将放线紫红素基因簇a c t 敲除载体p H L 737转入大肠杆菌E T 12567/pU Z 8002,接合转移到S B T 2中,得到A p r R接合转移子,再用P C R 方法筛选验证单交换菌株㊂通过影印筛选,从A pr R后代得到A pr S菌株,其中正确的双交换菌株不再产生蓝色的放线紫红素,菌株命名为S B T 4;同时观察到S B T 4大量合成红色的十一烷基灵菌红素(图3)㊂将十一烷基灵菌红素基因簇r e d 敲除载体p H L Y 32接合转移到S B T 4中,得到A p r R接合转移子,先进行单交换菌株筛选,再筛选双交换菌株,得到既不产蓝色A C T 也不产红色R E D (图3)㊁且不产钙依赖性抗生素C D A 的菌株(图4),命名为S B T 5㊂2.3 放线紫红素在SBT5中的表达质粒p MM 1上含有来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇,将p MM 1引入S B T 5和出发菌株T K 24中,以空载体p S E T 152作为对照,2个菌株均具有较高接合转移效率(数据未给出)㊂观察比较2个菌株表达次级代谢基因簇能力(图5)㊂结果显示野生型菌株加入空载体(T K 24ɨp S E T 152,含有A C T 和R E D 两个色素类抗生素基因簇)呈淡红色;用p MM 1引入额外拷贝a c t 基因簇后,含有2个a c t 基因簇拷贝的菌株T K 24ɨpMM 1产蓝色色素有所提高,而含p MM 1的S B T 5菌株大量产生放线紫红素,根据深蓝色判断其产量远远高于含有1个或2个拷贝a c t 基因簇的野生型菌株㊂超量表达A C T 的S B T 5接合转移子经过多次传代仍保持较高产量㊂在N A 培养基上培养T K 24及其突变株S B T 2㊁S B T 4和S B T 5,30ħ4d (平板背面)㊂T K 24a n di t s m u t a n tS B T 2,S B T 4a n dS B T 5w e r e c u l t u r e do nN Aa ga r p l a t e s f o r 4d ,30ħ.图3 T K 24及其抗生素基因簇敲除菌株产色素的表型观察F i g .3 P i g m e n t s p r o d u c t i o nb y TK 24a n d i t s g e n ec l u s t e r s r e pl a c e m e n tm u t a n t s 链霉菌在N A 培养基上发酵,发酵平板上的琼脂块用于生物测定㊂T K 24产生抑菌圈,S B T 5不产生㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t ed o nN Aa g a r ,t he n t h e a g a r p l u g sf r o mf e r m e n t a t i o n ag a r w e r eu s e d f o r th ebi o a s s a y.T K 24p r o d u c e daz o n eo f i n h i b i t i o n ,w h i l eS B T 5d i dn o t .图4 T K 24和S B T 5合成钙依赖抗生素的生物测定F i g .4 B i o a s s a y o f C D A p r o d u c t i o nb y TK 24a n dS B T 54第1期白亭丽等:变铅青链霉菌高效异源表达宿主S B T 5的构建在S MM S 培养基上接种链霉菌,30ħ培养4d ;S B T 5ɨp MM 1产生深蓝色的放线紫红素㊂S t r e p t o m yc e s s t r a i n sw e r e f e r m e n t e do n S MM Sa ga r ,30ħ,4d .S B T 5ɨp MM 1p r o d u c e dd a r kb l u e ac t i n o r h od i n .图5 S B T 5过量表达放线紫红素F i g .5 O v e r pr o d u c t i o no f a c t i n o r h o d i n i nS B T 53 讨 论基因组和宏基因组测序表明,自然界中的可培养或未培养微生物基因组中蕴含着丰富的次级代谢途径资源,是天然产物筛选的宝库㊂然而,由于大部分基因簇常处于沉默状态,采用传统方法很难继续从微生物中有效地分离到新的化合物㊂如何激活这些沉默或隐藏的基因簇以获得相应的化合物,是新药先导化合物发掘领域亟待解决的瓶颈问题[14-15],开发高效的异源表达方法无疑是其中重要的备选方案㊂变铅青链霉菌遗传背景清晰㊁遗传操作简单高效,是异源表达筛选技术的首选宿主菌,缺点是其含有内源色素和抗生素基因簇,且天然次级代谢能力不强㊂本研究针对这些特点,改造变铅青链霉菌,敲除了A C T ㊁R E D ㊁C D A 等3个内源抗生素的基因簇,同时为了激活或者高表达异源基因簇,还加入了一个多效性正调控基因a f s R S c l a ㊂来源于棒状链霉菌的a f s R S c l a 能够激活沉默的放线紫红素㊁钙依赖性抗生素和全霉素的生物合成,并大幅度提高棒酸的产量[8]㊂在本研究中也发现,在c d a 基因簇原位加上a f s R S c l a 后,菌株S B T 2大量合成放线紫红素;在进一步敲除a c t 基因簇后,由于没有蓝色色素干扰,在菌株S B T 4中又观察到十一烷基灵菌红素R E D 大量合成㊂这些结果表明,新引入的a fs R S c l a 可以促进不同类型抗生素的大量合成㊂无疑,高效表达宿主S B T 5菌株的成功构建和应用将为我们大量快速发掘新的天然产物提供很好的工具㊂参考文献[1] K I E S E R H M ,K I E S E R T ,H O P WO O D D A.Ac o m b i n e d g e -n e t i c a n d p h y s i c a lm a p o f t h e S t r e p t o m yc e s c o e l i c o l o r A 3(2)c h r o m o s o m e [J ].JB a c t e r i o l ,1992,174:5496-5507.[2] 郑华亮,白亭丽,陶美凤.大肠杆菌乙酰-C o A 羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响[J ].华中农业大学学报,2013,32(4):12-18.[3] HA N A HA N D .S t u d i e so nt h e t r a n s f o r m a t i o no f E .c o l i w i t h pl a s m i d s [J ].JM o l B i o l ,1983,166(4):557-580.[4] F L E T TF ,M E R S I N I A SV ,S M I T H CP .H i g h e f f i c i e n c y i n t e r -g e n e r i c c o n j u g a l t r a n s f e r o f p l a s m i dD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o -l i t om e t h y l D N A -r e s t r i c t i n g S t r e p t o m y c e t e s [J ].F E M SM i c r o -b i o l L e t t ,1997,155:223-229.[5] K E M P T E R C ,K A I S E R D ,H A A GS ,e t a l .C D A :c a l c i u m -d e -p e n d e n t p e p t i d ea n t i b i o t i c sf r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A 3(2)c o n t a i n i n g u n u s u a l r e s i d u e s [J ].A n g e w a n d t e C h e m i e I n t e r -n a t i o n a l E n gl i s hE d i t i o n ,1997,36:498-501.[6] HO P WO O DD A ,H I N T E RMA N N G ,K I E S E R T ,e t a l .I n t e -g r a t e dD N A s e q u e n c e si nt h r e es t r e p t o m yc e t e sf o r m r e l a t ed a u t o n o m o u s p l a s m i d sa f te r t r a n sf e r t o S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s [J ].P l a s m i d ,1984,11:1-16.[7] B I E R MA N M ,L O G A N R ,O B R I E N K ,e t a l .P l a s m i d c l o n i n gv e c t o r s f o r t h e c o n j u ga l t r a n s f e r o fD N Af r o m E s c h e r i c h i a c o l i t o S t r e p t o m y c e s s p p .[J ].G e n e ,1992,116(1):43-49.[8] C H E NL ,WA N GY ,G U O H ,e t a l .H i g h -t h r o u g h p u t s c r e e n i n g f o r S t r e p t o m yc e s a n t i b i o t i cb i o s y n t h e s i 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n g h a i J i a o t o n g U n i v e r s i t y,S h a n g h a i200030,C h i n aA b s t r a c t T h r e e g e n e c l u s t e r s c o n t r o l l i n g t h eb i o s y n t h e s i so f t h ea n t i b i o t i c s a c t i n o r h o d i n(A C T), u n d e c y l p r o d i g i o s i n(R E D)a n dc a l c i u m-d e p e n d e n ta n t i b i o t i c(C D A)w e r es e q u e n t i a l l y k n o c k o u t e db y g e n e r e p l a c e m e n t s f r o mt h e c h r o m o s o m eo f S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s T K24t od e r i v eSB T5.I nS B T5,t h e g l o b a l r e g u l a t o r yg e n e s a f s R S c l a f r o m S t r e p t o m y c e s c l a v u l i g e r u s w a s i n t e g r a t e d i nt h e p l a c eo f t h e c d a g e n e c l u s t e r.T h e a c t g e n e c l u s t e r f r o m S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r w a s i n t r o d u c e d i n t oS B T5t o t e s t i t s c a-p a b i l i t y o f e x p r e s s i n g s e c o n d a r yg e n e c l u s t e r.T h e r e s u l t i n g S B T5e x c o n j u g a n t s o v e r p r o d u c e dAC Tc o m-p a r i n g w i t hw i l d-t y p e s t r a i n sh a r b o r i n g d o u b l ec o p i e so f t h e a c t g e n ec l u s t e r.S B T5i sa ne f f i c i e n th o s t w i t ha c l e a n s e c o n d a r y m e t a b o l i s mb a c k g r o u n d s u i t a b l e f o r h e t e r o l o g o u s l y e x p r e s s i n g a n d s c r e e n i n g s e c-o n d a r y m e t a b o l i c g e n e c l u s t e r s.K e y w o r d s S t r e p t o m y c e s l i v i d a n s;h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o nh o s t;s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s;a n t i b i o t-i c b i o s y n t h e t i c g e n e c l u s t e r s;g e n ek n o c k o u t;a f s R S c l a(责任编辑:张志钰) 6。
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江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中Ⅲ型羊毛硫肽的异源表达
江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中Ⅲ型羊毛硫肽的异源表达
引言：
Ⅲ型羊毛硫肽是一种重要的生物活性多肽，具有广泛的应用前景。
为了提高Ⅲ型羊毛硫肽的产量和利用效率，研究人员开始寻找其他微生物进行异源表达。
江西伦茨氏菌和达窝链霉菌是优良的表达系统，因此本文研究了这两种菌株中Ⅲ型羊毛硫肽的异源表达。
方法：
本研究采用基因工程技术，将Ⅲ型羊毛硫肽的编码基因导入江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中。
通过PCR扩增Ⅲ型羊毛硫肽基因，并将其与表达载体连接。
然后，利用化学方法将改造后的载体导入到目标菌株中。
结果：
经过菌株的筛选和鉴定，成功获得了Ⅲ型羊毛硫肽在江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中的转基因菌株。
通过Western blot和质
谱分析技术，证实Ⅲ型羊毛硫肽已经在转基因菌株中表达。
此外，通过草酸获取高表达菌株，成功提高了Ⅲ型羊毛硫肽的产量。
讨论：
江西伦茨氏菌和达窝链霉菌是两种优良的表达系统，具有较高的表达效率和稳定性。
通过将Ⅲ型羊毛硫肽基因导入这两种菌株中，可实现异源表达。
实验结果表明，Ⅲ型羊毛硫肽在转基因菌株中得到了成功表达，并利用草酸法获得了高表达菌株。
这为进一步提高Ⅲ型羊毛硫肽的产量提供了有力的技术支持。
结论：
本研究成功地将Ⅲ型羊毛硫肽基因导入江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中进行异源表达，并获得了表达菌株。
通过进一步优化表达条件，草酸法可以用于提高Ⅲ型羊毛硫肽的产量。
这将为Ⅲ型羊毛硫肽的生产和应用提供重要的基础支持，并拓宽了Ⅲ型羊毛硫肽的研究领域。
致谢：
本研究得到了XX机构的资助，特此致谢他们的支持
本研究成功地将Ⅲ型羊毛硫肽基因导入江西伦茨氏菌和达窝链霉菌中进行异源表达，并获得了表达菌株。
通过进一步优化表达条件，草酸法可以用于提高Ⅲ型羊毛硫肽的产量。
本研究结果证实了江西伦茨氏菌和达窝链霉菌作为优良的表达系统的有效性和稳定性。
通过Western blot和质谱分析技术的验证，Ⅲ型羊毛硫肽已经在转基因菌株中成功表达。
这为进一步提高Ⅲ型羊毛硫肽的产量提供了重要的技术支持，并拓宽了Ⅲ型羊毛硫肽的研究领域。
特此致谢XX机构的资助。