蛋白质浓度测定-Bradford
bradford法名词解释
bradford法名词解释
Bradford法是一种快速简便的蛋白质浓度测定方法，由Bradford于1976年建立。
它是利用蛋白质与考马斯亮蓝G250结合后颜色变化大，最大吸收峰移至595nm，消光系数大等特性进行测定的。
具体实验步骤包括标准曲线的制作和样品检测，使用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光度。
此法的优点是灵敏度高、测定快速简便、干扰物质少，但用于不同蛋白质测定时偏差较大，且有一些物质干扰此法的测定。
它是目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一，广泛应用于生物检验领域。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
4、比色
各管室温静置2-5min后，在分光光
度计上测定595nm处的光吸收值 A595，空白对照为1号试管，标准 和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能 用玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%乙醇润洗，洗去颜色。
5、制作标准曲线
以标准蛋白质浓度
（mg/mL）为横坐标，吸 光度A595为纵坐标作图， 得到一条标准曲线。
EDTA等均不干扰此法。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的
偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，
以减少这方面的偏差。
2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质
有：去污剂Triton X-100,SDS和0.1mol/L的NaOH
白配成系列浓度。
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L ） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝染色法 （ Bradford 法）
实验人员：董佳琦 潘立
一、实验目的
掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理 和操作技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原
理设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测
定溶液中蛋白质浓度的方法。
尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，
实验一Bradford法测定蛋白质浓度
实验一Bradford法测定蛋白质浓度1.目的：练习标准曲线的制作，比较不同pH值的蛋白质标准溶液对测定的影响。
2.试剂：①显色剂：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%（w/v）磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。
②BSA标准溶液（1000µg/ml），分别用0.01N盐酸，去离子水，0.01N NaOH溶液配制，4℃冰箱放置可保存一周。
3.设备与仪器：微量注射器：一支用于专吸BSA；一支用于专吸dH2O岛津UV-265紫外可见光分光光度计4.操作程序：试管号 1 2 3 4 5 6BSA（µl）0 10 20 40 70 100去离子水（µl）100 90 80 60 30 0显色剂（ml） 5 5 5 5 5 5加显色剂混匀，静止2min后测定OD595，建立标准曲线注：①显色液中G-250，出现沉淀不能用。
②定容BSA标准液时，混合次数，以保证混匀。
实验二蛋白质的浓缩（PEG法）1.原理干PEG粉末吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。
PEG吸收水分的速度很快，为防止PEG进入蛋白质溶液，最好选用分子量大的PEG。
一般用分子量为20000的PEG。
2.试剂与设备牛血清白蛋白（BSA），聚乙二醇（PEG），玻璃纸，岛津UV-265紫外可见光分光光度计3.操作将一定浓度的BSA溶液20mL放入具有半透膜性质的方形玻璃纸中，用细线扎住口，放入盛有PEG干粉的培养皿中，让盛有BSA溶液的玻璃纸外周涂上PEG；当玻璃纸上的PEG干粉湿透后，抹去PEG，如此反复几次，就可达到浓缩的效果。
当样品浓缩至少于3mL时，进行OD280测值。
4.结果可直接比较浓缩前后OD值的变化；也可制作一个标准曲线，定量描述蛋白质浓度的变化。
表蛋白质浓度的标准曲线管号 1 2 3 4 5 标准BSA溶液（mL） 1 2 3 4 5 蒸馏水（mL） 4 3 2 1 0 蛋白质浓度（mg/mL）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ABS280标准BSA溶液的浓度为1mg/mL5.计算求回归方程，并利用该方程计算浓缩前后浓度的变化。
Brford法测蛋白质浓度
B r f o r d法测蛋白质浓度集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-B r a d f o r d法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。
测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、实验过程1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml 的BSA溶液。
计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。
用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml 的溶液，震荡使溶液混合均匀。
Bradford法测蛋白浓度
Bradford法测蛋白浓度一、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G─250 20mg溶于9.5mL乙醇中，加入17mL 磷酸和173.5ml蒸馏水。
二、标准和待测蛋白质溶液1．标准蛋白质溶液IFN-r紫外扫描定量，用0.15mol/L NaCl配制成1OD280/mL蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
DH5a 菌体蛋白和XL－Blue菌体蛋白，使用前用0.15mol/L NaCl稀释。
三、器材DU800四、操作方法1.制作标准曲线取7支离心管，按下表平行操作。
试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.06 0.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm测定结果如下：蛋白量（ug）580nm 1 580nm 2 580nm平均595nm 1 595nm 2595nm平均10 0.0814 0.0755 0.07845 0.0709 0.0671 0.06920 0.2335 0.2288 0.23115 0.2144 0.2188 0.216630 0.32 0.285 0.3025 0.307 0.2661 0.2865540 0.372 0.389 0.3805 0.3537 0.372 0.3628550 0.443 0.4927 0.46785 0.4196 0.4751 0.4473560 0.6408 0.528 0.5844 0.6224 0.5079 0.56515 实验过程中发现，蛋白与G-250混合后，吸收值不稳定，随时间变化。
2.扫描测试实验1）加20ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min ，结果：吸收值随时间逐渐下降，图谱名称:20110321 20 ug2）加60ug IFN-r，混合后扫描595nm吸收变化值，参比：450nm，时间：0——50min，测1次/min，结果：吸收值随时间逐渐下降，10——20min时变化幅度较小，图谱名称:20110321 60ug3）加40ug IFN-r扫描，混合后400——700nm波长扫描，分别在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30min时扫描，595nm吸收值随时间逐渐下降，450nm吸收值变化很小，变化值约0.001。
实验六蛋白质浓度测定--bradford法
稀释倍数
8
20
80
100
5
9
40
60
100
2.5
10
60
40
100
1.67
3.加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取样器分别加入5.0mL考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定。主要的干扰物质有：去污剂Triton X-100、十二烷基磺酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH（如同0.1mol/L的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定待测蛋白质的浓度。
100
6
80
20
100
7
100
0
100
2.将待测蛋白配成合适浓度
另取3支清洁试管，编号8、9、10，用微量注射器按表6-2操作，将待测蛋白配成系列浓度。
表6-2待测蛋白的稀释
管号
待测蛋白质（mL）
缓冲液（mL）
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要2min即可完成，其颜色可以在1h内保持稳定，且在5min～20min之间，颜色的稳定性最好，因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
Bradford法测蛋白质浓度的步骤1
Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。
测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、实验过程1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。
计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。
用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul 的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。
生物化学综合实验习题解答
生物化学综合实验习题解答综合实验一蛋白质的浓度测定―Bradford法1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？答：(1)由于蛋白与考马斯亮蓝G-250染料的结合能力不同，纵向倒转混合，充分反应。
(2)标准蛋白加入的量与考马斯亮蓝G-250的体积相差悬殊，纵向倒转混合，充分反应。
2．查阅相关资料、文献，举例说明测定蛋白质的浓度的方法有哪几种，并说明各自的优缺点。
答：主要的以下几种：（1）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法，优点是测定准确率高，可测定不同形态的样品。
缺点是测定过程繁琐。
（2）双缩脲法（Biuret法）优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（３）Folin―酚试剂法（Lowry法）此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，即Folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深蓝色的原因是在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
(４）考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在波长为595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
优点：a. 灵敏度高。
b 测定快速、简便，只需加一种试剂。
c. 干扰物质少。
缺点： a 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
b.物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
Bradford法测蛋白质浓度的步骤1
Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。
测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、实验过程1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为 1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。
计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。
用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul 的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。
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蛋白质浓度测定—Bradford法
一、实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理
考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250
的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大
吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合
比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标
准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，
再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支
三、操作方法
1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
标准蛋白
含量( g)
0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0
标准蛋白
溶液
（0.1mg/
mL）(mL)
0．1 0．2 0．3 待测蛋白
质溶液
(mL)
2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.
3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水
(mL)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
考马斯亮
蓝试剂
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
四、实验结果
1．标准曲线的绘制
2．蛋白浓度的计算
鸡血清稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.421
羊血清稀释200倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.500
肝匀浆稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.360
再将各所得OD值代入以下公式计算:
蛋白质含量(mg/mL)=(96.28﹡OD﹣9.1704)( μg)﹡稀释倍数/100(μL)
求得各样品浓度如下:
鸡血清=31.36 mg/mL
羊血清=77.94 mg/mL
肝匀浆=25.49 mg/mL
五、注意事项
1．如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。
2．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。