蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告)

蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法

（实验报告）

实验日期：2015年4月28日实验温度：室温

实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：***

班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：********

I. 实验目的

1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；

2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II. 实验原理

考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III. 实验试剂与仪器

1.实验试剂

(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

2.实验器材

可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。

IV. 实验操作步骤

1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂

混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。

标准曲线绘制数据表

012345样1样2标准蛋白μg

数

020*********

A59500.51

70.80

5

0.94

1

1.15

7

1.19

2

1.46

5

1.44

2.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。

V. 实验结果分析

结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。

VI. 注意事项

1. 考马斯亮蓝试剂加入后室温放置5～20min内比色，布的超过1h；

2. 蛋白质-染料复合物少量附于比色杯，不影响测定，可用乙醇洗净。

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