考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验二考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量一、目的与要求1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
附：（一）、分光光度法原理：光的吸收定律（朗伯-比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时,其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。
用公式表示为：T = I／I0则A = lg（1／T）=Kbc式中T —透光率I —透过光强度I0—入射光强度 A —吸光度K —比例常数 b —溶液的厚度 c —溶液的浓度（二）、离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
（三）、分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
仪器和试剂
1．仪器：
722型分光光度计；微量注射器；试管及试管架；刻度吸 管
2．试剂：
（1）标准蛋白质溶液：称取100mg 牛血清白蛋白，溶于蒸 馏水并定容至100ml，制成1mg/ml 的溶液。 （2）考马斯亮蓝G-250染液：称取100mg考马斯亮蓝G-250， 溶于50ml 95%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最 后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存，在常温中可 放置1-2个月。
3．若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈， 以免产生大量气泡而难于消除。
思考题
1． 说出你所知道的几种蛋白质定量测定的 方法，并与考马斯亮蓝染色法相比较各有 何优缺点？
2．根据下列所给的条件和要求，选择一种 或几种常用的方法测定蛋白质的浓度。 （1）样品不易溶解，但要求结果较准确； （2）要求在短时间内测定大量样品。 （3）要求很迅速地测定一系列试管（如30 支）中溶液的蛋白质浓度。
实验二
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
实验目的
掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的 原理和方法
学习分光光度计的原理及使用方法
实验原理
根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。 考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复 合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状 态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在 一定范围内，也就是当蛋白质含量在0~1000μg范 围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与 蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
双蒸水（ml） 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（μg）
0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0 20 40 60 80 100
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。
考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸三、操作步骤（一）试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1 g考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容到1000mL。
备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够。
2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100 μg/mL的牛血清蛋白原液。
（二）标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液（浓度控制在10~100μg/mL范围内）1mL，具体操作：取100-900 μl牛血清蛋白原液，水补足到1 mL，浓度相当于所取原液量的十分之一；2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min；3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值；4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程。
（三）目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定A595。
依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。
五、注意事项1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大，反应需控制在同一条件下进行。
2、比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用综述共26页文档
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
试剂与器材
1.试剂: (1)标准蛋白质溶液，用牛血清蛋白配制成
0.1 mg/ml (2)考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg
考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙 醇后，再加入120 mL 85 %的磷酸，用水 稀释至1L。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.器材 (1)紫外可见光分光光度计 (2)试管8支
操作步骤
五种不同蛋白质含量测定方法的比较值得注意的是除凯氏定氮法外其余四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定有可能得出四种不同的结果
考马斯亮蓝法测定 蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
➢在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中，反应式为: (NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
➢用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量 计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量，反 应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
四、实验步骤
㈠标准曲线的制作 取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀 。
试管编号
1
2
3
4
56
试剂
V（标准蛋白溶液） 0
／Байду номын сангаасl
20 40 60
V(0.9 ％生理盐水） 100 80 60 40
／μl
Ρ(蛋白质含量）／ 0
五、注意事项
⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在 100~800μg／ml为宜。
⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后 续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比 色皿。
预期结果
?Brandford染色液和蛋白液在酸性条件下结合，溶液颜 色由棕黑色转为蓝色。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。
★实验缺点
（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。
（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
试管编号 试剂
待测管（ U)
V( 样品提取液）0.1 ／ml
V（蛋白质标 — 准液)ml
标准管（S) 对照管（B)
__
__
0.1
V(0.9 ％生理 — 盐水）／ ml
V（考马斯亮 3.0 蓝试剂）／㏕
__
0.1
3.0
3.0
混匀放5min
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2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
（三）、结果计算
2. 分别向上述各管加入3.0ml考马斯亮蓝 G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后， 测定A595值。 3. 以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐 标，绘制标准曲线。
（二） 样品提取液中蛋白质含量的测定 1.蛋白质提取: 称取样品约200mg，加蒸馏水5ml， 匀浆，4000rpm离心10min， 取上清
3．测定 将待测样品的比色皿放入相应的样品穴，轻 轻拉动比色皿座架拉杆，使待测溶液进入光路， 测定。显示值（小数后三位数）即为待测样品的 吸光度值Ａ。 读数后，打开比色皿暗箱盖。 4. 关机 实验完毕，切断电源，将各调节旋钮恢复至 初始位置。将比色皿取出洗净，晾干，存于专用 盒内，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
分光光度计的分类
红外分光光度计: 测定波长范围为 大于760 nm的 红外光区
可见光分光光度计:
测定波长范围为 400~ 760 nm的 可见光区
测定波长范围为 200～400 nm的 紫外光区
紫外分光光度计:
可见光谱
可见光范围内波长和颜色的关系
分光光度计的基本结构
无论哪一类分光光度计都包括：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光 度计各部件的次序如图所示:
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等 （二）试剂 1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 1000µg /ml蛋白质标准液
【分光光度法的基本原理和分光光度计的 使用方法】
定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸 收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组 分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的 极少量物质。 应用: 生物化学研究中广泛使用的方法之 一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定 量检测。
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
测量条件选择
（1）仪器预热是保证仪器准确稳定的重要步骤。 （2）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。 比色皿与分光光度计应配套使用。 比色皿内盛 液应为其容量的2/3。 （3）选择适宜波长的入射光：由于物质对光有 选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵敏度， 必须选择溶液最大吸收波长的入射光。
入射光 强度 Io 单色器 样品池 透射光 强度 I
光源
检测器 及仪表
光照射到物质上，物质的分子结构决定 哪些特定波长的光被吸收。这一现象符 合符合朗伯－比耳定律。
入射光强度 Io 透射光强度 I
样品浓度c
光程 b
当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部 分被吸收，一部分透过溶液(I)
朗伯—比尔定律:
样品蛋白质含量（ µg/ g鲜重） =
m (µg) × 提 取 液 总 体 积 (ml )
测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）
式中： m为从标准曲线上查得的蛋白质含量， 单位为µg。
【实验步骤】
（一）、标准曲线的制作 1. 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。
试 剂 试管编号
1
0 100 0
2
20 80 20
3
40 60 40
4
60 40 60
5
80 20 80
6
100 0 100
1000µg/ml标准蛋白溶液 （µl）
0.9%生理盐水（µl） 蛋白质含量（µg/0.1ml）
【注意事项】
1）为了防止光电管疲劳不测定时须将比色皿暗箱盖 打开，使光路切断。 2）比色皿的使用方法： ①拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不 要碰比色皿的透光面。 ②每次做完实验时，应立即洗净比色皿。 清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。 必要时可用盐酸-乙醇混合洗涤液（1∶2）浸泡片刻，再 用水冲洗。不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿，。 不能用毛刷清洗。 ③比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干，以 保护透光面。 3）在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到 浓的顺序测定，以减小测量误差。
（4）控制吸光度A的准确的读数范围：吸光 度控制在0.1~0.8读数范围内时，测量的准确 度较高。 （5）选择参比溶液：参比溶液是用来调节仪 器工作零点的。无色样品可用蒸馏水作参比 溶液；反之应采用不加样品（加显色剂）的 溶剂作参比溶液。
722型光栅分光光度计使用方法
T/A切换旋钮
显示窗口 电源开关 消光零
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速， 约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳 定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系 数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低 检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰 性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方 面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的 蛋白质快速微量测定方法。