酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)

如果固定化酶的动力学仍服从米氏方程，则可 通过米氏常数Km值的大小来反映酶在固定化前后 活性的变化。
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
外扩散限制效应
由
Vm [S ]i Km [S]i
kLa ([S]0
[S]i )可得
Vm [S]i kLa Km [S]i
[S]0 [S]i
两边同除以[S]0，并给方程左边的分子分母
同除以[S]0得
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
本征动力学是指酶的真实动力学行为，包括溶 液酶和固定化酶。对于后者，它仅将空间效应的影 响考虑在内。从这个意义上讲，固定化酶的本征动 力学与溶液酶的本征动力学是有差别的。
固有动力学
分配效应造成的结果是使微观环境与宏观环境 的底物浓度出现差别，从而影响酶催化反应的速度。 如果在上述本征动力学的基础上，加上这种分配效 应造成的浓度差异对动力学产生的影响，所建立的 动力学称为固有动力学（inherent dynamics）。对 这种动力学比较简单的处理方法是：动力学方程仍 然服从米氏方程的形式，仅对动力学参数予以修正。
无（溶液酶） 丙酰玻璃
无（溶液酶） 可溶性醛葡聚糖
无（溶液酶） CM-纤维-70
无（溶液酶） 马来酸/1,2-亚乙基
Km（mol/L）
6.5×10－4 8.0×10－4 7.8×10－6 5.5×10－5
1.0×10－3 1.3×10－3 2×10－2 2×10－2 6.8×10－3 2.0×10－4
分配效应中的分配系数
这种分配效应一般采用液固界面内外侧的 底物浓度之比，即分配系数来定量表示。设界 面内侧的底物浓度为[S]i，界面外侧的底物浓度 为[S]o，则分配系数K可表示为：
K [S]i [S ]o
静电作用造成的分配效应
通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。 底物在溶液中也会离子化，这样在固定的电荷和移动 的离子之间，常会发生静电相互作用，产生分配效应。
Vd kL a ([S ]0 [S ]i )
式中：Vd 为底物由主体溶液扩散到固定化酶外表 面的速率，单位为mol/(L·s)； kL 为液膜的传质系数，“m/s”； a 为单位体积所具有的传质表面积，“m-1”； kL a 为体积传质系数，“s-1”； [S]0 为底物在主体溶液中的浓度，“mol/L”
第十章 固定化酶催化 的动力学特征
一、酶的固定化对其动力学特性的影 响 二、影响固定化酶动力学的因素 三、外扩散限制效应 四、内扩散限制效应
一、酶的固定化对其 动力学特性的影响
1．酶活性的变化 酶在固定化时，总会有一部分未被固定而残留
在溶液中，造成了酶的部分损失；同时由于各种原 因也会造成已被固定的酶的活性有所下降。这是大 多数固定化酶的情况，只有个别的酶在固定化后活 性未变或反而升高。
外扩散和内扩散
外扩散是指底物从主体溶液向固定化酶的外表 面的扩散，或产物从固定化酶的外表面向主体溶液 中的扩散。外扩散发生在酶反应之前或之后。由于 外扩散阻力的存在，使底物或产物在主体溶液和固 定化酶外表面之间产生浓度梯度。
内扩散是对有微孔的载体而言。底物从固定化 酶的外表面扩散到微孔内部的酶活性中心处，或是 产物沿着相反途径的扩散。对底物而言，内扩散限 制与酶催化反应同时进行。
式中：[S ] 为无因次底物浓度；
K 为无因次米氏常数；
Da为无因次准数，常称为Damköhler （丹克莱尔）准数。
外扩散限制效应
将上式整理成一元二次方程标准形式
2
[S] (Da K 1)[S] K 0
令
Da K
1
，代入上式得
2
[S]
[S] K
0
解此方程可得 [S] 2 4K
V Vm[S]i Km [S]i
因为 K [S]i ，
[S ]o
[S]i K[S]o
V Vm K[S]o Vm[S]o Vm[S]o
Km K[S]o
Km K
[S]o
K m [S]o
当Z和U异号时，K>1，Km Km，反应速度
增高；反之，K m
K
，反应速度降低；当任何
m
一方电荷为零时，Km 不变。
外扩散限制效应
假定一不带电荷的固定化酶，其外表面上的 反应速度符合米氏方程形式，即
Vi
Vm [S ]i Km [S]i
式中：Vi为底物在固定化酶外表面上的消耗速度，
又称宏观反应速度，单位为mol/(L·s)；
[S]i为底物在固定化酶外表面上的浓度，单 位为mol/L。
外扩散限制效应
底物由主体溶液扩散到固定化酶外表面的速 率应表示为
在这种情况下，酶反应速度与最大传质速率相 等，用 Vd max 表示。
外扩散限制效应
上述两种情况为两种极端的情况，一般的情
况处于这两者之间，称为过渡区，如图所示。在
过渡区的酶反应速度为宏观反应速度，它可由两
种方法求得。
（ 1 ） 由 [S]i 值 确 定 Vi值
在过渡区，[S]i 值应满足方程
Vm [S ]i Km [S]i
酶活性变化的评价指标
酶活性表现率： 指实际测定的固定化酶的总活性与被固
定化了的酶在溶液状态时的总活性之比。
酶活性收率： 指实际测定的固定化酶的总活性与固定
化时所用的全部游离酶的活性之比。
上述两种评价指标的差别在于是否考虑 了剩余的未被固定化的酶。
2．酶稳定性的变化
一般来说，酶被固定化后，无论是保存时的 稳定性，还是使用时的稳定性均有提高。据理论 推测，酶固定化后其半寿期将增加1倍。同时， 固定化酶的热稳定性也有所提高，要比溶液酶提 高10多倍。这是因为固定化后，酶的空间结构变 得更为坚固，加热时不易变性，增加了酶的热稳 定性。
有效动力学
不论分配效应是否存在，固定化酶受到扩散 限制时所观察到的反应速度称为有效反应速度， 此 时 的 动 力 学 称 为 有 效 动 力 学 （ effective dynamics），或称宏观动力学。由于生化物质在 溶液内和固定化酶微孔内的扩散速率是比较慢的， 所以扩散阻力是影响固定化酶催化活性的主要因 素，并且建立起来的有效动力学方程也不完全服 从米氏方程。
在讨论内扩散对固定化酶催化反应动力学的 影响时，常将均匀分布着酶的多孔球形颗粒作为 研究的模型。因此要首先研究颗粒载体的结构参 数和物质在微孔内的扩散。
1．载体的结构参数
a．比表面积Sg 它指单位质量载体所具有的内表面积，以
m2/g表示。通过实验测定，一般载体的比表面积 可达200～300m2/g 。
影响固定化酶动力学的因素
3．扩散效应 固定化酶催化反应时，底物必须从主体溶
液进入到固定化酶内部的活性中心处，反应的 产物又必须从固定化酶的活性中心传出到主体 溶液中。这种物质的传递过程主要是扩散过程， 扩散的速率在某些情况下会对酶反应速度产生 限制作用，特别是当扩散速率缓慢而酶的催化 活性又很高时，这种限制作用会相当明显。
固定化酶底物和产物 的分布状况
酶的本征动力学
空间效应难以定量描述，并且它与固定化方法、 载体的结构及性质、底物分子的大小和形状等因素 有关。空间效应的影响一般是通过校正动力学参数 Vm和Km来体现的。在此基础上建立起来的动力学 方程一般称之为本征动力学（intrinsic dynamics）， 所测得的反应速度称为本征反应速度。
根据Boltzman分配定律，分配系数K可以表示为
K exp ZFU RT
式中 Z—底物分子所带的电荷；F—法拉第常数；U— 载体的静电电势；R—气体常数；T—绝对温度。
当载体与底物所带的电荷相反时，K大于1；当两 者带有相同电荷时，K小于1。
考虑静电作用的反应速度方程
对于固定化酶催化的反应，其底物浓度应取 在固定化酶内外表面附近的微环境的数值。
二、影响固定化酶动力学 的因素
1．空间效应： （1）构象效应
酶的活性部位和变构部位的性质取决于酶 分子的三维空间结构。酶在固定化过程中，由 于存在着酶和载体的相互作用，从而引起了酶 的活性部位发生某种扭曲变形，改变了酶活性 部位的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力， 此种现象称为构象效应。