单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析
重组蛋白表征解析
重组蛋白表征目录1. 重组蛋白介绍重组蛋白治疗药物的生产 . ........................................................................04 ........................................................................04 从药物发现到药物开发 ............................................................................04 蛋白治疗药物的表征 ................................................................................05 执行关键的QA/QC 程序 . ......................................................................... 05 应对重组蛋白药物表征的挑战 (05)2. 生物过程监控 .........................................................................06 生物过程分析技术总结 ............................................................................08 安捷伦应用文献........................................................................................ 083. 完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析技术汇总 . ................................09 ......................................11 安捷伦应用文献........................................................................................ 124. 糖基化分析糖链分析技术汇总 . .............................................................................13 . ................................................................................... 17 安捷伦应用文献........................................................................................ 185. 肽图分析肽图分析技术汇总 . .................................................................................19 . ................................................................................... 22 安捷伦应用文献........................................................................................ 226. 电荷异构体电荷异构体分析技术汇总 . ............................................................................ 23......................................................................... 25 安捷伦应用文献........................................................................................ 257. 聚集聚集体分析技术汇总 . ........................................................................................26 ................................................................................28 安捷伦应用文献........................................................................................ 288. 氧化氧化分析技术汇总 . .........................................................................................29 ....................................................................................31 安捷伦应用文献........................................................................................ 319. 氨基酸分析氨基酸分析技术汇总 .............................................................................32 . ....................................................... ........................ 34 安捷伦应用文献. (34)3重组蛋白治疗药物的生产从药物发现到药物开发4过去，大多数药物都是化学合成的小分子。
单克隆抗体的应用与研究
单克隆抗体的应用与研究单克隆抗体是一种特殊的抗体，由单个克隆的浆细胞所分泌。
相比多克隆抗体，单克隆抗体具有更好的特异性和稳定性，因此在医学、生物学、分子生物学等领域有广泛的应用。
本文将介绍单克隆抗体的研究进展和应用。
一、单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备可以分为三个步骤：免疫原制备、免疫动物及其免疫和细胞融合和筛选。
首先需要制备免疫原，这个免疫原通常是目标抗原或者抗体对其特异性的区域片段。
如果是目标抗原，通常要首先纯化得到。
其次，需要为制备单克隆抗体的动物进行免疫。
一般是选择小鼠等实验动物，将免疫原注射到动物身体内，让它们产生特异性抗体。
之后，需要从这些动物体内获取免疫细胞，即B淋巴细胞。
最后，需要使用细胞融合技术通过融合免疫B细胞和癌细胞，来获取产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
这些细胞能够长期分泌具有特异性的抗体，并形成混合瘤。
通常，这些细胞的混合物需要进行严格的筛选和鉴定，以确保其产生的抗体都是特异性单克隆抗体。
二、单克隆抗体的应用1. 诊断和治疗单克隆抗体在临床上的应用越来越广泛。
例如，它们可以用于诊断和治疗晚期癌症。
新兴的单克隆抗体医学治疗（Monoclonal Antibody Therapy，MAT）被评价为一种有希望的抗癌治疗方法，特别是在血液系统的癌症治疗方面。
由于单克隆抗体的特异性，可以通过将它们与药物或放射性同位素结合，使它们更好地治疗癌症。
2. 分子生物学在分子生物学领域，单克隆抗体经常用来在Western blotting和其他分析技术中检验目标蛋白质的存在。
单克隆抗体还可用于免疫共沉淀、免疫沉淀、染色和免疫组化等实验中。
3. 生物分子检测单克隆抗体也广泛应用于药品研究和开发，例如用于高度灵敏的免疫印迹，以检测蛋白质、肽和DNA序列等生物分子。
此外，单克隆抗体还用于流式细胞术、细胞分选、病毒、菌和细胞诊断。
三、单克隆抗体的未来单克隆抗体作为一种新型的生物技术，其应用领域正在不断拓宽。
人用重组单克隆抗体产品总论
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90 无菌容器密封以防污染，如需冷冻干燥，先进行冷冻干燥再密封。
91 3. 产品检定
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应根据产品关键质量属性、对产品和工艺理解认识的积累和风险评估的原则，制定
93 相应质量控制策略。产品检定采用的检测方法应经验证并符合要求。纳入质量标准的检
94 定项目、可接受标准限度，应结合来自于临床前和／或临床研究时多批样品的数据、用
42 参比品
43
选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个/多个批次，或用一个代表批次作为参比
44 品，用于鉴别、理化和生物学活性等各种分析，并应按特性分析要求进行全面分析鉴定。
45 中间品
46
生产工艺的设定应优先采用连续不间断的生产方式，如需储存中间品，应对中间品
47 的贮存条件进行验证，证明该贮存条件不影响后续工艺用物料的质量指标和产品在有效
4
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120
采用适宜的方法对供试品氧化产物、脱酰胺产物或其他结构不完整分子进行定量分
121 析。供试品测定结果应在规定的范围内。
122 3.2.4 工艺相关杂质
123
采用适宜的的方法对供试品宿主蛋白、宿主细胞和载体 DNA、蛋白 A 及其他工艺
124 相关杂质进行检测。供试品测定结果应在规定的范围内。
27 原、产品相关杂质和工艺相关杂质的去除、纯化用材料（如色谱柱填料）的重复使用性
28 的可接受限度、产品质量属性批间一致性、抗体偶联药物的偶联方法或基于品种质量属
29 性的其他抗体修饰方法、以及对生产中所需一次性材料的监控等。
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30 特性分析
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应采用现有先进的分析手段，从物理化学、免疫学、生物学等角度对产品进行全面
重组单克隆抗体相关物质和相关杂质的研究与评价_韦薇
906［作者简介］韦薇，女，审评员，主要从事药品审评工作。
联系电话：（010）68585566，E-mail ：weiw@cde．org．cn 。
重组单克隆抗体相关物质和相关杂质的研究与评价韦薇，罗建辉，尹红章，项金忠（国家食品药品监督管理总局药品审评中心，北京100038）［摘要］重组生物技术制备的单克隆抗体（以下简称重组单抗）是生物制品中一类重要的药物类别。
近年来，由于其精确的靶向杀伤和中和等生物学效应，重组单抗在肿瘤、自身免疫性疾病等方面受到了广泛的研究和应用，并且在神经学、眼科学等其他疾病领域的研究也开始逐步发展起来。
目前，国内生产的重组单抗主要采用真核细胞培养表达的方法，在工艺研发和质量研究方面，药品企业对主要有效成分的结构研究和质量控制关注较多；但是对产品组成中的杂质和相关物质研究较少或关注度不够。
考虑到这些杂质或相关物质是重组单抗产品中的重要组成部分，将会影响到产品的质量、临床应用的安全性和有效性，应在研究中予以重视。
本文对重组单克隆抗体产品中相关杂质和相关物质的研究和评价进行了探讨。
［关键词］重组单抗；产品相关物质；产品相关杂质；工艺相关杂质［中图分类号］Ｒ95［文献标志码］C［文章编号］1003－3734（2014）08－0906－06Comments on the development and assessment of the drug impuritiesand substances related to recombinant monoclonal antibodiesWEI Wei ，LUO Jian-hui ，YIN Hong-zhang ，XIANG Jin-zhong（Center for Drug Evaluation ，China Food and Drug Administration ，Beijing 100038，China ）［Abstract ］Ｒecombinant monoclonal antibodies have been established as a major product class of biotech-nology-derived medicinal products and widely applied in the clinical fields of oncology ，autoimmune disease as well as neurology ，ophthalmology and so on ，due to their precisely targeted biological activates of cytotoxic and neutrali-zing effect in recent years．Nowadays ，pharmaceutical enterprises of China usually pay more attention towards the structure and quality control of the main substance produced from eukaryotic cells ，rather than the related impurities and substances．However ，these impurities and substances are parts of the product components ，and may impact on product quality 、clinical safety and effectiveness．Therefore ，they should be recognized as equally important as the main substance and be investigated．This article will present comments on the research and evaluation of the related impurities and substances in recombinant monoclonal antibody products．［Key words ］recombinant monoclonal antibody ；product-related substances ；product-related impurities ；process-related impurities重组单抗在表达、制备或是储存过程中，由于各种微环境的影响，如机械剪切、氧化作用、酶的作用等物理、化学或生物因素，导致抗体的降解或发生翻译后修饰，从而获得异质性（heterogeneity ），产生变异体（variants ），如片段化、氧化、脱氨基等。
单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发-Waters
pH 6.0
0.24
USP分离度 = 1.3
0.22
聚集体 = 5.3%
0.20
0.18
pH 6.8
0.16
USP分离度 = 1.3
0.14
聚集体 = 5.7%
0.12
pH 7.6
0.10
USP分离度 = 1.1
0.08
聚集体 = 5.3%
0.06
0.04
0.02
0.00
方法条件 LC条件： 系统：
波长： 色谱柱：
柱温： 样品温度： 进样体积： 流速： 流动相： 最终组成：
数据管理 软件：
配备TUV和钛合金流通池 的ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统
214和280 nm
ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm, 4.6 x 150 mm, 部件号186005225
为了展示这些影响，我们在4.6 x 150 mm以及4.6 x 300 mm的色谱柱上运行了一组蛋白标准品。 校准曲线的对比结果显示，与150 mm色谱柱相比，300 mm色谱柱的校准曲线斜率更加平缓， 说明增加色谱柱长度可增强其分离能力(图6)。
150 mm
蛋白质
分子量
6.5
300 mm
甲状腺球蛋白 670000
除了蛋白质标准品外，我们还评估了溶于50-250 mM氯化钠中的小鼠单克隆抗体(mAb) 的SEC分离情况(图2)。正如通常会在凝胶过滤填料上观察到的一样2，较大的离子强度 可减少mAb单体的峰拖尾现象并使峰形更窄。当氯化钠浓度从50升至200 mM时，mAb的 峰高从0.189升至0.289。USP拖尾因子也从1.64降至1.22。而当流动相离子强度从200升 至250 mM氯化钠时，上述变化不再明显(USP拖尾因子 = 1.20)。
蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)
记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入
底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高 ELISA 的灵敏度。
操作过程：
抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和 检测 三 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如 FITC、R-PE 等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针， 然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 （一）细胞膜蛋白分子的检测 原理： 细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或 配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量 每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察 或流式细胞计分析。 2 间接法：细胞＋抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析 悬浮细胞：用 PBS 洗二次后再做染色 贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V 检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行 荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞 仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加 入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再 加入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为 阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 （二）细胞内蛋白分子的检测 细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白 TFAR19 的检测等。 操作过程： （1）直接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或 流式细胞计分析 （2）间接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗 →洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的 TFAR19 单 克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期
单克隆抗体等电点
单克隆抗体等电点
单克隆抗体（mAb）的一个重要特征是它们的等电点（pI），本质上是抗体不带净电荷时的pH值，该值取决于抗体所含的带电氨基酸。
如果周围环境的pH值低于抗体的pI，则该分子带有净正电荷，而当pH值高于pI时，抗体将带有净负电荷。
在评估治疗性抗体的药代动力学（PK）特性时，靶介导的药物处置（TMDD）与非靶标相关机制都会影响整体PK行为，pI是后者的重要因素。
由于大多数细胞表面带负电荷，抗体需要带正电荷以进行有效的液相内吞作用（胞饮作用），因此环境pH值需要低于抗体的pI。
常用的检测单克隆抗体等电点的方式有电聚焦凝胶电泳（IEF）、阳离子交换色谱（CEX）、阴离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。
等电点值反映了蛋白质药物电荷与空间构象的均一性。
在实际应用中，单克隆抗体等电点的准确测定对于抗体药物的生产和质量控制至关重要。
单克隆抗体基础知识
1 .在肿瘤治疗方面的应用: 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不
良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药——重组人 源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生
联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高
30%以上。
2 .在器官移植中的应用: 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐
人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段
（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力
，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。
全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用 。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬 菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B
——进行SDR移植改良
嵌合抗体
人源化抗体
3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody)
在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密 切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一 步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗 体潜在的免疫原性降至最低。
4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)
药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆 抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗
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单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。
监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。
在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。
尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。
在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。
这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。
这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。
这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。
另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。
在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。
抗体或蛋白聚体的分类聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。
分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。
下表1列出了生物制药中最常见的聚体类别。
为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。
聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。
聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50µm）。
在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。
就其分子量而言，大小大于10的二次方kDa的聚体潜在的不良免疫原性反应潜力，值得更仔细的评估。
聚体除大小外，聚体随时间的大小变化率是一个有用的参数，可以提供聚体的功能特征，其中时间对应蛋白质产品的有效期。
聚体最初可以小二聚体或碎片的形式存在，并朝着更大的聚集结构变化，例如亚可见或可见颗粒（如果这种转变在热力学上温度变得快速）。
在任何给定的时刻，蛋白质可能在有利于蛋白质单体或天然构型的热力学状态与有利于展开的天然蛋白质构型状态之间转变。
在某些的条件下，未折叠的蛋白质可能与其他天然和非天然形式形成复合物，在获得足够的自由能以转变为可能成为新蛋白质实体而形成稳定状态的聚体。
科学家Lumry和Eyring在1960年代研究了这些转变的基础，他们提出了溶液中蛋白质聚体的动力学转变，并在干扰素-γ聚集的情况下进一步转变为一级转变反应动力学。
评估药品聚体总增长率的过程很复杂。
单一药物产品通常具有不均匀的聚体混合物（如上表1）。
稳定的蛋白制品具有异质性溶液中存在的聚体，但与更不稳定的制品相比，其生长速率很小。
聚体的增长速度加快的更加令人担忧，可能需要更积极的控制和聚体控制最小化策略。
蛋白质聚集的来源蛋白质药品的聚体可以有多种来源，并且各种类型的聚体可以存在于所分装的药品瓶中。
蛋白质聚体形成的潜力存在于蛋白质药物制造的各个阶段。
从蛋白质序列和特征开始，每种蛋白质将具有可使其或多或少的稳定物理化学特征。
例如，游离巯基水平升高而发现在培养物中会产生聚集的CHO细胞表达的单克隆抗体（MAb）的聚集情况，如果将硫酸铜添加到培养物中，则可以防止这种情况的发生。
随着多种蛋白质形式与其环境相互作用的可能性增加，蛋白质异质性也可能是蛋白质聚集的一个促成因素。
对于依帕珠单抗，二硫键会有利于共价聚体的形成。
治疗性单克隆抗体通常以高浓度配制，这也有利于增加分子相互作用的发生率，因此有可能形成聚体。
因此，药物制造商花费大量时间和精力来开发一种制剂，制剂将使蛋白质药物产品在其有效期内保持稳定，无论是在溶液中还是冻干产品。
例如，将蔗糖添加至白介素-1受体激动剂或冻干MAb制品以抑制或减少聚体的形成。
生产、保存、运输中的大量冷冻对蛋白的质稳定制备提出了挑战，因为在溶液冷冻期间会发生溶质浓缩作用。
理想的策略是在–80℃下同时冻结整个溶液，并迅速冻结，这样可以最大程度地减少热变迁（例如低共熔）和玻璃化转变。
此策略对于大批量解决方案不切实际。
大量冷冻期间溶质浓度和pH的变化也可促进蛋白质聚集。
大量的解冻也带来这方面的挑战，这主要与冰-液界面的表面吸附有关。
当需要大量冷冻和解冻时，适当的制剂配方就变得至关重要，而赋形剂可以作为蛋白质冷冻保护剂来使用。
分装和生产工操作可能会由于剪切力而使蛋白质发生机械变性，或者会引入杂质，这些杂质会作为蛋白质聚体的成核源。
例如，某些活塞式泵类似于汽车发动机活塞与润滑油相互作用的方式与蛋白质药物产品相互作用。
蛋白药物产品和活塞杆之间的紧密接触会破坏原本稳定的药物产品。
对于抗体药物产品来说就是这种情况，使用吸光度和光遮蔽方法确定其聚体颗粒的水平随着泵送次数的增加而增加。
在活塞脱落的情况下，不锈钢钝化可以降低将不锈钢沉积物引入最终药物中的风险，这种情况可能会导致蛋白质异核化。
新的输送系统增加了容器兼容性，并增加了形成蛋白质聚体的可能性。
小瓶中的玻璃，塞子中的橡胶，塞子和注射器中的硅树脂以及注射器中的钨这些异物，它们可能会进入蛋白质药物产品。
这些异物中许多都是带静电的，因此有可能与蛋白质，蛋白质聚集体和蛋白质聚体的前体发生相互作用，形成异核。
对于预填充的注射器来说就是这样，其中包含在注射器针筒制造过程中脱落的钨颗粒，这些钨颗粒用作聚体的形成。
蛋白质聚体的研究基于聚体动力学模型，蛋白质聚体可能比其单体更具疏水性。
这是因为当蛋白质转变为天然的、部分展开的状态并暴露其疏水残基时，可能会发生蛋白质聚集。
研究表明，聚体比单体使用硫酸铵沉淀效果更好，并且它们与聚偏二氟乙烯（PDVF）膜的结合更牢固。
通常，通过将蛋白质溶液暴露于高温、pH、湿度和光入射的极端条件下来研究聚集体，这就是所谓的强制降解和光降解研究。
基本原理是基于这样的期望：蛋白质以这种方式降解反映了蛋白质药物的有效期中所经历的降解途径。
这些参数在建立稳定性研究程序时也是非常有价值的。
蛋白质聚集研究的另一个重要部分是评估聚体的生物学活性。
与单体蛋白质活性相比，聚体的生物活性的差异会深刻影响蛋白质药物的功效。
在这种情况下，产品功效可能会受到影响。
通常，基于风险的聚体评估可能需要进行特定的研究，以帮助阐明哪种类型的聚体更令人担忧。
对药品在其有效期中所处的不同环境进行全面调查，包括制造、存储、运输、冷冻和解冻周期、氧气暴露、光照和物理作用力等等。
蛋白质聚体的检测生物制药工业中可用于检测，表征，定量和监测生物制药蛋白产品中聚体的分析方法数量在不断的增加。
下表2列出了用于检测，监视和研究聚体的最常用方法。
尽管表述并不全面，但表2提供了分析方法的一般概念及其主要优点和局限性。
可用的测试方法可以分为两类：检测小聚集体的方法，例如二聚体，LMW，HMW，可溶性聚体和蛋白质片段（表2的第一部分），以及检测大聚集体的方法，例如不溶的亚可见和可见的颗粒（表2的第二部分）。
在用于检测小聚集体的一组测试方法中，体积排阻色谱法（SEC）通常用于批次放行期间的常规检测和聚体监测。
不适合批量生产的方法可以用其他表征或验证来测试。
尺寸排阻高压液相色谱法是对二聚体，LMW和HMW物等蛋白质聚体使用最广泛的分析方法。
该方法适具有高灵敏度、精密度、分离度、准确性，可以高通量进行分析测试。
但是，作为色谱方法，它也可能导致聚集，导致样品制备过程中现有聚集物被去除，或者在无法区分或回收HMW物时低估了聚集物的存在。
SEC的主要局限性可能是需要以低浓度（例如1mg/mL）进样。
对于治疗性蛋白质，这通常意味着稀释100倍，导致可逆的可溶性聚集体分解。
这种担忧导致了更普遍的问题，例如，总体概况的相关性如何？它代表最终药品中存在的聚集体吗？如其他地方所述，没有一种能够评估给定蛋白质溶液中存在的所有聚集体的分析方法。
通常需要几种方法的组合来覆盖可能存在的聚集体的微观和宏观范围。
另外，由于每种方法的局限性，可能需要正交实验来确认方法。
例如，SEC结果可能需要使用其他正交方法（例如分析超速离心（AUC））进行确认。
AUC可以用作确认方法，因为它提供了良好的聚体分离，并且不需要样品稀释或样品制备。
在用于聚体表征的方法中，场流分离（FFF）和动态光散射（DLS）能够直接评估溶液中的聚集体（无需稀释）。
FFF的检测范围比SEC 的检测范围宽，但是可以解决浓缩样品的数据分析困难的问题。
DLS 是一种很好的定量方法，读数与表面积成正比，因此，如果大小差异不够大，大聚体可以掩盖小聚体的检测。
热量法对于评估蛋白质溶液的稳定性非常有用，因为它可以检测蛋白质的解离和折叠。
某些方法可以组合使用，以拥有更强大的分析工具，例如质谱联用色谱法，可提供有关化学和物理降解的信息。
此外，根据美国药典（USP），通常使用显微镜和光遮盖法检测和计数亚可见颗粒）<788>章。
两种测试都适用于小批量和大批量产品，但通常在此类测试中使用多个药品瓶样品。
样品首先通过光遮蔽法进行测试。
如果样品未达到规定的限值，则可以使用显微分析方法。
但是，如果有技术原因或正在测试的产品产生干扰，使光遮蔽方法不合适或结果无效，则显微镜方法可能是唯一的测试方法。
浊度法根据参考标准测量溶液的乳浊度或透明度。
光遮蔽，比浊法和DLS的组合已用于评估蛋白质溶液中颗粒形成的过程。
当这些方法与检测到的聚体的表观球状尺寸相关时（如下图1），用于检测和监测直径在几纳米到50纳米之间的小聚体方法的能力就存在差距，这种差距可能会造成因为检测，测量和评估某些小聚体以及较大聚体前体的运动能力可能无法在蛋白质聚体控制策略中实现。
实际上，已经指出表观球状直径约为0.5 µm的聚集体没有得到常规跟踪和分析。
蛋白质聚体的控制制药商采用了各种方法来控制蛋白质药物中的聚体，这取决于聚体的性质和水平，以及它们对特定蛋白质产品的安全性、质量、稳定性的潜在影响。
尽管蛋白质药物产品可能包含的性质和大小与通过适当监控无法控制的某些聚体，但某些聚体可能需要根据其风险评估要求采取积极的控制策略。
在某些情况下，控制措施是为了减少或抑制聚体的形成。
有时，各种条件的改变可以提高易于聚集的蛋白质产品的稳定性，例如在冻融过程中的控制策略也可能包括添加赋形剂。
重组人血小板活化因子就是这种情况，重组人血小板活化因子在储存时通过与二氧化硅颗粒异核形成聚体。