单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析

单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析

生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。

抗体或蛋白聚体的分类

聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。下表1列出了生物制

药中最常见的聚体类别。为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50µm）。在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。就其分子量而言，大小大于10的二次方kDa的聚体潜在的不良免疫原性反应潜力，值得更仔细的评估。

聚体除大小外，聚体随时间的大小变化率是一个有用的参数，可以提供聚体的功能特征，其中时间对应蛋白质产品的有效期。聚体最初可以小二聚体或碎片的形式存在，并朝着更大的聚集结构变化，例如亚可见或可见颗粒（如果这种转变在热力学上温度变得快速）。在任何给定的时刻，蛋白质可能在有利于蛋白质单体或天然构型的热力学状态与有利于展开的天然蛋白质构型状态之间转变。在某些的条件下，未折叠的蛋白质可能与其他天然和非天然形式形成复合物，在获得足够的自由能以转变为可能成为新蛋白质实体而形成稳定状态的聚体。科学家Lumry和Eyring在1960年代研究了这些转变的基础，他们提出了溶液中蛋白质聚体的动力学转变，并在干扰素-γ聚集的情况下进一步转变为一级转变反应动力学。评估药品聚体总增长率的

过程很复杂。单一药物产品通常具有不均匀的聚体混合物（如上表1）。稳定的蛋白制品具有异质性溶液中存在的聚体，但与更不稳定的制品相比，其生长速率很小。聚体的增长速度加快的更加令人担忧，可能需要更积极的控制和聚体控制最小化策略。

蛋白质聚集的来源

蛋白质药品的聚体可以有多种来源，并且各种类型的聚体可以存在于所分装的药品瓶中。蛋白质聚体形成的潜力存在于蛋白质药物制造的各个阶段。从蛋白质序列和特征开始，每种蛋白质将具有可使其或多或少的稳定物理化学特征。例如，游离巯基水平升高而发现在培养物中会产生聚集的CHO细胞表达的单克隆抗体（MAb）的聚集情况，如果将硫酸铜添加到培养物中，则可以防止这种情况的发生。随着多种蛋白质形式与其环境相互作用的可能性增加，蛋白质异质性也可能是蛋白质聚集的一个促成因素。对于依帕珠单抗，二硫键会有利于共价聚体的形成。

治疗性单克隆抗体通常以高浓度配制，这也有利于增加分子相互作用的发生率，因此有可能形成聚体。因此，药物制造商花费大量时间和精力来开发一种制剂，制剂将使蛋白质药物产品在其有效期内保持稳定，无论是在溶液中还是冻干产品。例如，将蔗糖添加至白介素-1受体激动剂或冻干MAb制品以抑制或减少聚体的形成。

生产、保存、运输中的大量冷冻对蛋白的质稳定制备提出了挑战，因为在溶液冷冻期间会发生溶质浓缩作用。理想的策略是在–80℃下同时冻结整个溶液，并迅速冻结，这样可以最大程度地减少热变迁（例如低共熔）和玻璃化转变。此策略对于大批量解决方案不切实际。大量冷冻期间溶质浓度和pH的变化也可促进蛋白质聚集。大量的解冻也带来这方面的挑战，这主要与冰-液界面的表面吸附有关。当需要大量冷冻和解冻时，适当的制剂配方就变得至关重要，而赋形剂可以作为蛋白质冷冻保护剂来使用。

分装和生产工操作可能会由于剪切力而使蛋白质发生机械变性，或者会引入杂质，这些杂质会作为蛋白质聚体的成核源。例如，某些活塞式泵类似于汽车发动机活塞与润滑油相互作用的方式与蛋白质药物产品相互作用。蛋白药物产品和活塞杆之间的紧密接触会破坏原本稳定的药物产品。对于抗体药物产品来说就是这种情况，使用吸光度和光遮蔽方法确定其聚体颗粒的水平随着泵送次数的增加而增加。在活塞脱落的情况下，不锈钢钝化可以降低将不锈钢沉积物引入最终药物中的风险，这种情况可能会导致蛋白质异核化。

新的输送系统增加了容器兼容性，并增加了形成蛋白质聚体的可能性。小瓶中的玻璃，塞子中的橡胶，塞子和注射器中的硅树脂以及注射器中的钨这些异物，它们可能会进入蛋白质药物产品。这些异物中许多都是带静电的，因此有可能与蛋白质，蛋白质聚集体和蛋白质

聚体的前体发生相互作用，形成异核。对于预填充的注射器来说就是这样，其中包含在注射器针筒制造过程中脱落的钨颗粒，这些钨颗粒用作聚体的形成。

蛋白质聚体的研究

基于聚体动力学模型，蛋白质聚体可能比其单体更具疏水性。这是因为当蛋白质转变为天然的、部分展开的状态并暴露其疏水残基时，可能会发生蛋白质聚集。研究表明，聚体比单体使用硫酸铵沉淀效果更好，并且它们与聚偏二氟乙烯（PDVF）膜的结合更牢固。

通常，通过将蛋白质溶液暴露于高温、pH、湿度和光入射的极端条件下来研究聚集体，这就是所谓的强制降解和光降解研究。基本原理是基于这样的期望：蛋白质以这种方式降解反映了蛋白质药物的有效期中所经历的降解途径。这些参数在建立稳定性研究程序时也是非常有价值的。

蛋白质聚集研究的另一个重要部分是评估聚体的生物学活性。与单体蛋白质活性相比，聚体的生物活性的差异会深刻影响蛋白质药物的功效。在这种情况下，产品功效可能会受到影响。通常，基于风险的聚体评估可能需要进行特定的研究，以帮助阐明哪种类型的聚体更令人担忧。对药品在其有效期中所处的不同环境进行全面调查，包括制造、存储、运输、冷冻和解冻周期、氧气暴露、光照和物理作用力