哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

哺乳动物细胞培养生产流感疫苗

摘要

动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。动物细胞培养是现代生物制药的重要技术之一，不仅可以通过直接培养动物细胞制备相关药用产品，而且还可以将动物细胞作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用物质。对于许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对分子质量较大、结构较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。

传统的流感疫苗生产多采用鸡胚培养，但该生产过程易受微生物污染、内毒素残余量高、对流感大流行应急能力差，因此基于哺乳动物细胞培养的病毒疫苗工业的发展变得尤为重要。本文重点是MDCK细胞生产流感疫苗的研究以及临床应用现状。

研究背景

动物细胞培养是在动物组织培养基础上发展起来的，起源于19世纪的某些胚胎学技术，奠基人是美国生物学家哈里森(Harrison)。1907年，哈里森采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，使细胞存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。法国学者卡雷尔(Carrel)设计的卡氏培养瓶1923年用于培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大地推动了动物细胞培养技术的建立。

流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其临床特征是全身不适症状比一般感冒厉害，能引起心肌炎、肺炎和支气管炎等多种并发症，而且可以侵犯所有的年龄层。由于流感病毒具有高度传染性，能在短期迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界范围内的大流行。20世纪，甲型流感病毒曾引起过4次全球流行，1918－1919年的西班牙流感(H1N1)，历时18个月，导致二千万至四千万人死亡，是历史上最严重的一次流感暴发。进入21世纪，禽流感成为危害世界养禽业发展的重要因素。2004年至今，由甲型H5N1流感病毒引起的禽流感病毒肆虐全球多个国家和地区，并且由染病禽类传染到人，累计造成250多人死亡。世界卫生组织数据显示，每年有5%～15%的人会感染季节性流感，重症病例达三百万至五百万。

抗病毒药物常用作抵抗流感的应急药物。目前，获准用于流感病毒感染治疗的四种药物：金刚胺和金刚乙胺通过干扰病毒颗粒M2蛋白离子通道功能间接抑制病毒复制；扎那米韦和奥赛米韦是神经氨酸酶抑制剂，可以阻止病毒从细胞膜上正常释放。这些药物可以有效抑制流感病毒，但因其可能对人体产生不良反应及可能诱导耐药等缺点，面对大范围长时间的流感大流行，药物往往也无能为力。

目前，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方式，可有效减少季节性和大流行性流感对公众健康的影响。因此，病毒疫苗的生产受到广泛关注。现有4种类型的疫苗应用于预防流感、全病毒疫苗、裂解病毒疫苗和病毒亚单位疫苗，另外还有冷适应流感活病毒疫苗。全病毒流感疫苗的副作用较大，在国外已经不再使用，国内也正逐渐被取代。目前已上市的流感疫苗基本都是使用鸡胚培养制备，国内外使用鸡胚培养疫苗已经有50年历史。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的SPF级的鸡胚，鸡胚带有潜在的污染可能，而且培养周期过长，不易于控制产量，不利于应对大规模的流感爆发。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。在诸多的后续产品中，最值得期待的还是使用细胞培养的流感疫苗。

1.流感疫苗的生产方法

1.1鸡胚培养法

自1933年鸡胚培养流感疫苗获得成功以来，鸡胚培养法成为大量获得流感疫苗的主要手段。半个世纪以来，流感疫苗一直在受精鸡蛋(鸡胚)中培育，现已上市的疫苗大都使用鸡胚培养法制备。在生产疫苗的过程中，鸡胚主要用作培养介质，是病毒生长所需的特殊环境。由于疫苗生产工序要求严格，合格的鸡胚除了保证病毒存活外，还应是健康鸡群的受精卵，一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周岁；同时，鸡群必须经过定期检测，确保在生长过程中没有任何禽流感等相关疾病；受精卵内也不能存在任何病毒。因此就难免会遇到一些问题，例如：一方面，对鸡蛋要求严格，不是每只鸡蛋都可以用来生产疫苗，只有经过认证的养鸡厂才可以提供此类鸡蛋；另一方面，每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，但是典型的流感病毒包含三个菌株，因此现有生产方法效率很低。不仅如此，现有方法需要大量的受精鸡蛋。仅为满足美国现有人口，就需要2.7亿只受精鸡蛋，如果要满足中国现有人口，这个数字可能要达到9亿，所以一旦鸡蛋有问题，整个疫苗计划就宣告失败。近年来，高致病性禽流感的暴发告诫人们届时疫苗可能不够用。采用鸡蛋培养病毒，生产多少疫苗必须提前做出精确计划，然而流感暴发时，一般来说人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。受上述因素的限制，鸡胚供应量一直较小，另外用鸡胚生产疫苗需要消耗大量无特定病原体(SEP级)的鸡胚，且鸡胚有潜在的污染可能，培养周期长，不易控制产量和质量，故不利于应对大规模的流感暴发。因此，需要研究一种可在流感大流行时能替代鸡胚快速、大量生产流感疫苗的细胞培养法。

1.2细胞培养法

高等哺乳动物细胞可以很好表达修饰大分子的具有生物活性的蛋白产品。目前，哺乳动物细胞表达系统生产药用蛋白的发展速度远超过酵母、大肠杆菌表达系统。动物细胞生物制药已成为疫苗、基因工程药物、抗体药物、蛋白药物等生

物制品生产的重要技术。

近年来，美国政府和世界卫生组织都积极推进使用细胞培养技术替代鸡胚培养技术生产流感疫苗。利用连续细胞培养系统生产流感疫苗具有操作简单、规模

易放大；与鸡胚培养系统相比，细胞培养系统中繁殖的病毒与原流感病毒分离株

的匹配度更高；另外，通过细胞培养系统制备流感疫苗可以克服鸡胚生产的疫苗

可能引发人体过敏反应的缺点。除此之外，与鸡胚培养法相比，大规模动物细胞

培养生产流感疫苗在生产工艺上也有很多优势(表1)。更为重要的是，新的细胞

培养法有助于人类灵活应对大规模暴发的流感。因此，在人和动物对流感疫苗需

求不断增加的形势下，细胞培养能在短期内提供足够疫苗产品，且能避免鸡胚感

染的风险。而且，哺乳动物细胞培养的流感病毒与临床样本更为相似。因此，利

用细胞培养流感疫苗已成为目前流感疫苗研制的重要方向。

表1 鸡胚与细胞培养生产流感疫苗的比较

生产方式工艺过程优点缺点

鸡胚培养法 1.鸡胚培养工艺成熟 1.可能含有未知污染

2.培养候选疫苗株 2.不能应对大规模突发流感大流行

细胞培养法1.细胞培养分离候选疫苗株

2.检查细胞疫苗的单向免疫扩散试剂

3.细胞培养疫苗的制造

可规模化、快速大量

生产、易于质量控制，

纯度高、稳定性好

1.需要适宜细胞系的鉴定

2.工艺相比鸡胚培养略显不成熟

2.MDCK细胞培养生产流感疫苗

细胞培养法制备流感疫苗所使用的哺乳动物细胞主要包括MDCK细胞、Vero 细胞和PER.C6细胞。哺乳动物细胞具有无外源因子污染、易于规模化生产、抗原稳定等优点，因此培养的流感疫苗具有较好的免疫原性，接种后不良反应轻，较为安全。MDCK细胞在安全性、免疫原性及培养方面具有明显优势。

MDCK细胞从犬肾获得，该细胞在平板上培养时会合成的紧密连接蛋白可分泌到表面球状顶部形成单细胞层。MDCK细胞系可以用于多种病毒的繁殖和纯化，如：呼肠孤病毒、腺病毒、犬细小病毒、猫粒细胞缺乏症病毒和禽流感病毒等。迄今为止，很多研究都聚焦于对各种微载体上MDCK细胞生长特性的揭示以及与不同细胞系和卵细胞产毒规律的比较，还有微载体大规模培养系统中MDCK 细胞生长和病毒复制过程的代谢规律。

在MDCK细胞培养生产流感疫苗过程中存在的最大问题是细胞生长需要血清，由于血清成分复杂，批次质量差异较大，价格昂贵。因此，迫切需要开发MDCK细胞的无血清培养技术。

2.1激素替代的无血清培养