综诉利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇的技术路线及其影响因素
南方红豆杉悬浮细胞培养生产紫杉醇及其细胞培养物的化学成分研究
南方红豆杉悬浮细胞培养生产紫杉醇及其细胞培养物的化学成
分研究
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)又称美丽红豆杉,是特产于我国的一个变种红豆杉,广泛分布在我国大部分地区。
南方红豆杉的树皮、叶、根、枝等部位均含有紫杉醇。
为了保护、合理利用已有的南方红豆杉资源,自上个世纪90年代开始,我国就对南方红豆杉开展了人工栽培、植物组织培养等研究。
植物细胞培养因其繁殖速度快,培养条件易于优化,可以人工控制培养过程,实验过程不受时间、气候等因素的影响,同时提取纯化过程相对简单等优点,受到了人们越来越多的关注。
本论文对南方红豆杉的嫩茎进行愈伤组织的诱导,成功获得一株高产紫杉醇细胞株,并对其进行扩大培养。
为了提高紫杉醇的含量,我们在愈伤组织诱导试验中对外植体进行了选择,对诱导过程中的条件进行了优化,最终选定的条件为:B5基本培养基,添加1mg/L 2,4-D、0.1 mg/L 6-BA、100 mg/L Vc、0.2928 g/L谷氨酰胺与15 g/L蔗糖,p H调至5.8,黑暗下培养。
在此条件下,紫杉醇的含量最高达到了100 mg/L(鲜重);除主要目标产物紫杉醇,我们还对细胞培养物进行了系统的化学成分研究,并运用各种色谱手段从中分离得到了15个化合物,利用MS,UV,IR,NMR,单晶X-衍射等方法鉴定了其中13个化合物的结构,包括1个新化合物,4个首次从南方红豆杉细胞培养物中得到的化合物。
在此基础上,我们对该细胞培养物进行LC-MS色谱峰的指认,同时还对获得的部分化合物进行了体外抗肿瘤活性的初步研究。
浅析细胞培养生产紫杉醇的影响因素及对策
浅析细胞培养生产紫杉醇的影响因素及对策摘要：紫杉醇是一种有效治疗多种癌症的天然植物，具有高效、低毒、广谱、作用机制独特等特点，然而不断增长的抗癌药物需求和红豆杉资源的缺乏，为紫杉醇的工业化生产带来了很大压力，利用植物细胞培养生产紫杉醇被公认是一种有效的途径。
本文着重阐述了一些因素对紫杉醇产量的影响，以及利用生物反应器进行细胞培养时存在的问题，并针对这些影响因素给出了相应的对策。
并提出提高紫杉醇产量的方法，在文章最后给出了一些建议。
关键词：红豆杉紫杉醇细胞培养影响因素对策利用细胞悬浮培养方法提取紫杉醇是近年来红豆杉研究的一个重要课题。
自1989年首次报道细胞培养法生产紫杉醇以来，各国学者开展了广泛研究，目前细胞培养已经取得了较大进展，但还存在诸多需要克服的技术性难题。
紫杉醇是红豆杉属植物的次级代谢物，植物细胞培养生产次级代谢产物包括两个重要环节，一是细胞生长，二是产物合成。
这两个环节的任何影响因素都会影响到生产效率。
具体因素包括生物因素、物理因素和化学因素。
另外，本文还阐述了反应器对实验的影响及一些反应器的结构创新。
一、生物因素1、细胞株大量的研究表明，植物细胞的分化与次生代谢物的合成有密切的关系。
这些分化不但包括整植株、器官、组织，还包括细胞和亚细胞水平的分化。
分化的细胞、组织、器官往往有较高含量的次生代谢物。
因此，在生物反应器中通过大规模培养分化组织、器官、甚至整个植株可以生产次生代谢物。
目前，植物细胞培养所采用的培养物有细胞团块、绿色愈伤组织、冠瘿组织、不定芽（原基）、茎段、正常根、毛状根、畸形芽、胚（胚状体）甚至整个小植物。
2、褐变红豆杉属植物愈伤组织的诱导、继代培养过程中，细胞会分泌大量的棕色色素物质，这些色素物质的积累会影响愈伤组织生长，愈伤组织受毒害而逐渐转为暗褐色至黑色，这种现象称为褐变。
该现象与常见的木本植物培养初期发生褐变不同,后者通过选用较小外植体、频繁继代等一般可以克服,且以后不会发生;而就红豆杉而言,无论何种外植体来源的愈伤组织,常连续发生褐变,严重时会抑制细胞的增殖生长以至致死,使用抗氧化剂、吸附剂等多种方法,都只能减轻褐化[1]。
利用红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇
利用红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇摘要：I.简介- 红豆杉和紫杉醇的背景介绍II.愈伤组织的提取- 什么是愈伤组织- 为什么愈伤组织可以用于提取紫杉醇- 提取过程的步骤III.紫杉醇的用途- 紫杉醇的药用价值- 紫杉醇在医药领域的应用IV.结论- 利用红豆杉愈伤组织提取紫杉醇的意义- 未来展望正文：I.简介红豆杉是一种常绿乔木，属于紫杉科。
它不仅是一种观赏植物，还具有很高的药用价值。
红豆杉中提取出的紫杉醇是一种抗肿瘤药物，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等多种癌症具有显著的疗效。
因此，研究如何高效地从红豆杉中提取紫杉醇具有重要的意义。
II.愈伤组织的提取愈伤组织是植物在受伤后产生的一种特殊的组织，它能够进行迅速的分裂和生长。
红豆杉的愈伤组织位于树皮内侧，含有丰富的紫杉醇。
通过在红豆杉的愈伤组织上切割出小片，然后将其浸泡在一种特殊的提取液中，可以有效地提取出紫杉醇。
提取过程的步骤主要包括：红豆杉愈伤组织的收集、切割、提取液的配制、浸泡、提取、浓缩和纯化。
其中，提取液的配制和浸泡过程是影响提取效率的关键步骤。
III.紫杉醇的用途紫杉醇是一种具有广泛药用价值的物质，可以用于治疗多种癌症。
紫杉醇能够抑制癌细胞的分裂和生长，从而达到治疗癌症的目的。
目前，紫杉醇已经成为治疗卵巢癌、乳腺癌等癌症的重要药物之一。
除了用于治疗癌症外，紫杉醇还具有其他的药用价值。
例如，紫杉醇可以用于治疗糖尿病、病毒感染等多种疾病。
因此，研究如何高效地从红豆杉中提取紫杉醇具有重要的意义。
IV.结论利用红豆杉愈伤组织提取紫杉醇是一种有效的方法。
通过改进提取技术和提高提取效率，可以更好地利用红豆杉资源，为治疗癌症等疾病提供更多的药物资源。
紫杉醇的大规模培养及其影响因素
课程名称细胞工程课题紫杉醇的大规模培养及其影响因素学院酿酒与食品工程学院专业生物工程姓名学号指导老师老师紫杉醇的大规模培养及其影响因素钟坤1酿酒与食品工程学院生工112班摘要：紫杉醇是一个从红豆杉植物中提取的对多种癌症都具有较好疗效的天然药物。
近几年植物细胞培养生产紫杉醇的尝试性研究不断有突破性进展，综合当今研究报告，对利用植物细胞培养大规模生产紫杉醇过程及其影响因素作一定的分析与概述。
关键字：紫杉醇、细胞培养、红豆杉、影响因素紫杉醇是一种复杂的天然的抗癌药物，属于二萜生物碱，其基本结构由浆果赤霉素Ⅲ和连接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物构成。
1982年紫杉醇开始在临床上进行试验，1989年完成II期临床，1990年进行Ⅲ期临床，1992年12月29日美国正式批准用于晚期卵巢癌、肺癌、子宫癌的治疗。
它是经认证、目前最好的天然抗癌药物之一，可广泛用于肺鳞癌、肺腺癌、乳腺癌、睾丸胚胎癌、卵巢癌、恶性胸腺癌、胆囊癌、食道癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、生殖细胞癌、头颈癌等肿瘤的治疗，特别是晚期卵巢癌的治疗。
1995年中国医学科学院药物研究所研制的国产紫杉醇原料(从云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和美丽红豆杉五种植物中提取，纯度达98％以上)、据估算，从1000~2000棵稀有的紫杉树皮中只能提取lkg紫杉醇，而对l例病人制各充足的药物需3～4棵百年的老红豆杉树。
由于红豆杉属植物中紫杉醇的含量极低，远远不能满足市场的要求。
为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，多年来，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了大量工作，紫杉醇的全合成已取得成功，但皆因路线长，收率低等原因目前无法实现工业化．化学半合成是一条扩大紫杉醇来源的较好途径，国外已用半合成法生产紫杉醇，但化学半合成所用前体巴卡亭III和10一去乙酰巴卡亭III等仍要依赖于从红豆杉属植物中提取，限制了它的应用，利用植物细胞培养技术生产紫杉醇是一种大有前途的途径。
红豆杉细胞组织培养生产紫杉醇的综述
１ ． 简介 红豆杉又名紫杉 ，是世界公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌 植物 ， 红豆杉 的提取物紫杉醇 ， 因具有独特的抗癌机理 ， 被认为 是人类同癌症抗争的最有利武器。 在全世界共有十一种 ， 目前我 国共有四个种和一个变种 ， 即云南红豆杉 、 西藏红 豆杉 、 东北红 豆杉 、 中国红豆杉和南方红豆杉 （ 变种） 红豆杉产生 的二萜类次 药物， 亢 具有独特的抗癌机理 ， 因此红豆杉倍受关注『 。 ２ ］ 紫杉醇是红豆杉属植物 中的一种复杂的次生代谢产物， 也 是目前所了解 的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管 的药物。同位素示踪表明， 紫杉醇只结合到聚合 的微管 上， 不与 未聚合的微管蛋 白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞 内 积累大量的微管 ， 这些微管的积 累干扰了细胞 的各种功能， 特别 是使细胞分裂停止于有丝分裂期 ， 阻断了细胞的正常分裂 。 通 过 Ⅱ一ⅢＪ 研究， Ｉ 紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌 ， 对肺癌 、 大肠癌 、 黑色素瘤 、 头颈部癌 、 淋巴瘤 、 脑瘤也都有一定疗效 。 解决药源的问题的方法说来应该就两个大方面 ，即人工合 成和生物技术方法 ，也就是化学合成和利用相关生物技术解 决 紫杉醇 的药源 问题。但是 ， 由于紫杉醇化学结构 的复杂眭 ， 这就 意味着紫杉醇的化学合成在经济上是不可行的 ：而且紫杉醇 的 半合成原料 ， 例如从针叶红豆杉所分离得到的巴卡亭 Ⅲ， 也要从 红豆杉属植物中提取获得 【。这样看来 ， ３ 】 人工合成的方法 ， 不论 是全化学合成还是￣４ ＆合成 ， － ｇ 其可行 艮 。 低 从生物技 术角度来看 ， 人们主要从遗传转化 、 人工栽培 、 真 菌生产和植物细胞培养等几个方面尝 试解 决紫杉醇的药源 问 题 ，而其 中的细胞培养因具有众多优点而成为商业化生产 的首
红豆杉体外培养生产紫杉醇技术介绍
紫杉醇分离与提纯
• 有机溶剂-超声波提取法 高效液相色谱gt;提取时间>料液比 最优方案：原料95℃烘干至恒重，粉碎100目， 95%甲醇，60℃提取20h，料液比1:10 得率：0.086mg/g
Reference
• 内生真菌：生活在健康植物体内，但不引起任何 病害性状的真菌。
• 菌种分离：从外植体上长出的菌丝中，挑取不同菌落的菌 丝尖端接种到PDA培养基中培养，多次纯化后可得纯株。 • 目前已分离的内生真菌种类不同，产物多样，包括紫杉醇， 紫杉酚，芳香族氨基酸脱羧酶等。其中紫杉醇产率 0.024～185.4ug/L，发酵产量很低。生物改造的真菌紫杉 醇产率也仅有448.52ug/L，远未达到工业化水平。
红豆杉
• 红豆杉科红豆杉 属，全世界共 11种。
• 西藏红豆杉，东 北红豆杉，云南 红豆杉等。 • 二级濒危植物
紫杉醇（Taxol）
1个卵巢癌患者=6棵 树龄60～100年的红 豆杉 200kg/年紫杉醇 =1000000棵红豆杉
紫杉醇（Taxol）生产
• • • • • 1从红豆杉非树皮部位提取 2大量种植筛选的优良品种 3化学合成：半合成，全合成 4寻找紫杉醇类似物：Taxotere 5生物技术：细胞培养，基因工程，微生物 生产
与传统的整株材料相比,植物细胞悬浮体系具有分散性好、 细胞形状及细胞团大小大致相同,而且生长迅速、重复性 好、易于控制等优点。
红豆杉细胞悬浮培养
• Bestoso F等欧洲榛的茎，树叶和胚作为外 植体
• 第一步培养： MS培养基+3.0mg/LNAA+0.5mg/L激动素 +100mg/L精氨酸+2.5%蔗糖+0.8%琼脂 培养2个月，对胚形成愈伤组织的诱导率可86.4%， 枝条的诱导率100% 。 一段时间后转移到B5培养基上后，可加快愈伤组 织的生长。
利用红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇
文章标题：红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇的研究与应用一、引言红豆杉作为一种重要的天然植物资源，其愈伤组织作为提取紫杉醇的重要来源，一直备受关注。
本文将从红豆杉的愈伤组织性质、紫杉醇的提取方法和应用研究三个方面展开讨论。
二、红豆杉的愈伤组织性质1. 红豆杉的愈伤组织特点红豆杉的愈伤组织在组织结构、生长特性和代谢活性等方面具有独特性，为紫杉醇的提取提供了重要的基础条件。
2. 愈伤组织的培养条件对红豆杉愈伤组织的培养条件进行详细介绍，并探讨对紫杉醇含量和生长速率的影响。
三、紫杉醇的提取方法1. 传统提取方法介绍传统的红豆杉愈伤组织提取紫杉醇的方法，并对其优缺点进行分析和评价。
2. 新技术的应用介绍目前在红豆杉紫杉醇提取中使用的新技术，如超临界流体萃取、微波辅助提取等，并对其效果进行评估。
4. 紫杉醇的应用研究1. 化学成分和药理作用对紫杉醇的化学成分、药理作用进行详细阐述，从分子水平和整体作用机制上揭示其多功能性。
2. 临床应用和前景展望介绍紫杉醇在临床上的应用情况和治疗效果，并展望其在肿瘤治疗、抗癌药物开发方面的前景。
五、个人观点和总结红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇作为一种重要的研究领域，具有广阔的应用前景和深远的意义。
在未来的研究中，应充分利用现代生物技术和化学技术，不断提升紫杉醇的提取效率和纯度，以更好地发挥其药用价值。
通过深入研究红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇，我们对该过程的原理和应用有了全面的认识和了解。
这样的了解对于我个人来说具有非常重要的意义。
希望通过文章的阐述能够让更多的人了解并重视这一研究领域，从而推动相关科研工作的进展。
结束语通过本文的详细介绍和讨论，相信读者对红豆杉的愈伤组织提取紫杉醇的研究与应用有了更深入的了解。
同时也希望本文的内容能够对您的学术研究和实践工作有所帮助。
期待更多的科研人员和爱好者能够加入到这一领域的研究和探讨中，共同推动红豆杉愈伤组织提取紫杉醇领域的发展与进步。
红豆杉作为一种重要的天然植物资源，其愈伤组织提取紫杉醇的研究和应用正在逐渐受到人们的关注。
紫杉醇产量影响因素
影响紫杉醇生产的因素和提高产量的方法摘要综述红豆杉细胞培养，内生真菌培养等方法生产紫杉醇的影响产量的各种因素。
并且列举一些提高产量的方法。
关键词紫杉醇；生产；产量；方法紫杉醇是一种高效的抗癌药物，它能与微观蛋白结合，促进其聚合，抑制癌细胞的有丝分裂，阻止癌细胞的无限增殖。
目前，人们获得紫杉醇的途径主要有：红豆杉中提取，细胞培养，微生物发酵，化学合成等。
而红豆杉中紫杉醇含量非常低，加之该属植物生长极其缓慢，因而目前多研究后几种方法生产紫杉醇。
1 红豆杉细胞培养利用红豆杉细胞培养能够连续均匀生产，外界条件影响不大，而且可以在生物反应器中大规模培养，易于提高产量和进行产物的分离提取纯化，是目前工业化生产的首选方法。
1.1 外植体的选择茎段比离体叶片更易诱导出愈伤组织，带叶茎段外植体比不带叶茎段外植体形成愈伤组织要早些，诱导率也稍高;以树皮作为外植体诱导效果不佳。
红豆杉树的品种对外植体愈伤组织的诱导率和诱导速度也有影响。
以云南红豆衫的诱导率最高，诱导速度也最快，相对而言东北红豆衫较差。
外植体采样季节对愈伤组织的诱导有影响。
云南红豆杉早春取样的茎段形成愈伤组织的时间要比秋季取样早得多，春、夏季取样的东北红豆衫茎段形成愈伤组织的时间、比率均高于秋季取样，而且形成的愈伤组织颜色较浅.同以紫杉醉含量高的外植体作为诱导材料，可获得紫杉醉产量高的细胞系。
云南红豆衫和中国红豆杉愈伤组织中紫衫醉含量较高，是获得紫衫醉高产愈伤组织系的外植体的较佳来源。
1.2 培养基1.2.1种类外植体的愈伤组织诱导率与培养基种类有关。
在MS培养基上，东北红豆衫幼叶的诱导率最高，而在BS培养基上，幼茎的诱导率最高。
[1]1.2.2 N源培养基中氮源影响红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醉的含量。
培养基中NO3-浓度高有利于红豆杉愈伤组织的生长.而NH4+浓度高则抑制愈伤组织的生长，但可提高紫衫醉的含量。
1.2.3 pH培养基的pH值是影响红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的重要因素。
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综诉利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇的技术路线及其影响因素、对策摘要红豆杉细胞培养是工业化生产紫杉醇的很有前景的途径之一。
综述了红豆杉细胞培养过程中外植体的选择、愈伤组织的诱导、培养方式、生物反应器及培养动力学等方面的最新研究进展,并对今后利用细胞培养工厂化生产紫杉醇尚需解决的问题作了简略的探讨。
关键词红豆杉;细胞培养;紫杉醇紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物中分离出的一种二萜类化合物,对卵巢癌、子宫癌、乳腺癌等十几种癌症具有很好的疗效,它目前已在临床上作为乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。
然而从天然生长的红豆杉树中提取紫杉醇无法满足需求,药源不足已成为限制紫杉在临床中大量应用的瓶颈。
植物细胞培养具有不破坏自然资源及不受自然条件限制等优点。
目前利用细胞大量培养技术生产紫杉醇的研究已经进入到生物反应器放大阶段，红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇有望获得突破。
为解决紫杉醇的药源问题，人们从以下几个方面进行了研究：全合成、半合成、人工栽培、真菌生产和植物细胞培养等方法。
其中细胞培养法由于具有下述优点成为人们进行商业生产的优选方法：(1)能够确保产物无限、连续、均匀地生产，不易遭受病虫害、季节等因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并且通过控制环境条件提高紫杉醇产量；(3)所得产物比从植物体内直接提取简单，可以大大简化分离和纯化步骤; (4)除提供紫杉醇外，还可以生产出前体及其他有抗癌活性而原植物所不含的化合物。
技术路线 1 愈伤组织的诱导与培养1. 1 外植体的选择外植体对于愈伤组织的诱导率、生长状况等具有重要影响。
红豆杉属植物愈伤组织的诱导相对比较容易。
根、茎叶、树皮、形成层、大配子体、种子胚、假种皮、幼苗胚轴、芽等都可作为外植体诱导出愈伤组织,但不同外植体其愈伤组织的诱导率及愈伤组织生长情况差别很大。
茎段的诱导效果较好,而树皮、叶片较差。
1. 2 培养基及激素的选择对于红豆杉愈伤组织的诱导与培养,多数报道的适宜培养基为基本的或经改良的B5 【1】培养基。
然而,也有不同的研究结果报道。
以南方红豆杉芽为外植体,最适诱导培养基为MS 【2】,对愈伤组织的增殖、驯化和紫杉醇的积累则以B5 为最佳。
1. 3 培养条件黑暗条件有利于愈伤组织的诱导、生长和紫杉醇的形成,紫杉醇的产量高于光照条件下的3 倍。
愈伤组织诱导与培养的适宜温度为20～25 ℃。
对于细胞悬浮培养而言，培养基的主要成分相同于固体培养基，只是去掉了琼脂,大多使用B5培养基。
悬浮培养中，使用的碳源大多为蔗糖，果糖对紫杉醇含量的提高有一定的作用，而半乳糖对细胞生长作用显著。
高浓度蔗糖（40 g.L-1)能提高培养细胞紫杉醇的含量。
果糖能提高一般细胞紫杉醇的含量，但对高产培养物来讲，果糖没有作用。
蔗糖有利于细胞生长，而葡萄糖抑制紫杉烷的合成。
糖的补充有缩短悬浮细胞生物量增加时间的作用。
植物激素对悬浮培养细胞的生长和紫杉醇含量有较大的影响。
2,4-D一般抑制次生代谢产物的合成，促进细胞生长。
2,4-D 浓度在1.0～3.0 mg.L-1之间时，培养细胞中紫杉醇的含量与2,4-D浓度呈负相关。
适当改变生长素与激动素比例可提高紫杉醇含量,当其比例为5～10时，紫杉醇含量较高。
1. 4 愈伤组织褐变现象的控制红豆杉属植物愈伤组织的诱导、继代培养过程中,细胞会分泌大量的棕色色素物质,这些色素物质的积累会影响愈伤组织生长,愈伤组织受毒害而逐渐转为暗褐色至黑色,这种现象称为褐变。
1.5其它培养条件在黑暗条件下，悬浮细胞生长较好，紫杉醇产量高于光照条件下的3倍。
接种量对细胞生长和紫杉醇合成有明显影响。
实验证明，细胞接种量不应低于70 g(FW).L－1，当接种量低于50 g.L－1时，生长停止。
接种量在80～110 g.L-1时，生长速度没有明显差异。
当接种量从1.5增加到3 g.L-1(DW)时, 紫杉醇含量增加30%, 6 g.L-1(DW)接种量时，可在较短时间内获得较多的生物量，但接种量进一步增大,紫杉醇合成则受到抑制。
不同浓度氧气、二氧化碳和乙烯对细胞生长和紫杉醇产量有很大影响。
低浓度氧气（体积比10%）促进紫杉醇产生，高浓度二氧化碳（体积比10%）则表现为抑制作用。
最佳气体组合为：10%氧气、0.5%二氧化碳及5×10-6乙烯。
高浓度氧气促进钙的吸收和抑制磷的吸收，说明气体能改变细胞对营养物质的吸收分配，直接影响细胞生长和紫杉醇的产生。
影响因素2、1 无机盐对红豆杉细胞生长及紫杉醇生产影响通过对氮、磷等无机盐在红豆杉细胞悬浮培养中的吸收状况，无机盐对细胞常量及紫杉醇产量的影响研究表明：培养液中的磷酸盐在培养初期迅速、大量地被吸收；中其时几乎没有吸收；但是到培养后期则又可检测出磷酸盐的存在。
说明此时细胞中的磷酸盐向外渗透到了培养液中；与此相反，硝酸盐的吸收率则较为缓慢，尤其在培养的中期。
培养基中氮源影响红豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的含量。
培养基中硝酸根离子浓度高有利于红豆衫愈伤组织的生长,而氨根离子浓度高则抑制愈伤组织的生长,但可提高紫杉醇的含量。
2、2 培养基的pH 值的影响培养基的pH 值是影响红豆杉愈伤组织生长及紫杉醇含量的又一重要因素。
对东北红豆杉而言,较高pH 值对生长有利,pH 值为7. 0 时愈伤组织生长状态最好,但pH值为6. 0 时愈伤组织中紫杉醇的含量最高;对南方红豆杉而言,pH 值为5. 5 时对愈伤组织的生长最为有利,pH 值为7. 0 时紫杉醇的含量最高。
可见,有利于愈伤组织生长的pH 值不同于次生代谢产物合成所需的适宜pH 值。
紫杉醇的产量取决于生物量的增加和其中紫杉醇含量两方面的因素,因此,用细胞培养法生产紫杉醇时需综合考虑愈伤组织生长和紫杉醇形成对各种培养条件的不同要求。
在培养基中添加适宜浓度的有机物可以提高愈伤组织的诱导率和生长状况。
添加10 %的椰子汁(CM) 可提高外植体愈伤组织的诱导率和生长势,添加10 %的椰子汁或0.1 %的水解酪蛋白(CA) 可使红豆杉的愈伤组织生长得更快,并且可使愈伤组织维持更长时间,其中CM 的效果比CA 的效果更好[11 ] 。
盛长忠等【3】的研究也表明培养基中添加CA 能促进南方红豆杉愈伤组织的生长,但高浓度(0. 5 %) CA 不利于紫杉醇的积累,以0. 1 %为宜,既能促进愈伤组织的生长,又不影响紫杉醇的含量。
2、3 培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养的影响培养基中激素、激素的浓度及激素之间的组合对愈伤组织的诱导和培养起着重要作用。
适宜浓度的NAA、2 ,42D、62BA、赤霉素( GA3 ) 、IAA、IBA、等都可促进红豆杉愈伤组织的诱导和生长,但在效率上存在差异。
对中国红豆杉进行的实验表明,添加2. 0 mg/ L的2 ,42D 较易诱导出愈伤组织,2. 0 mg/ L的NAA 也具有较好的诱导效果, IAA 单独使用不能使外植体形成愈伤组织;对于愈伤组织的生长而言,4. 0 mg/ L的NAA 效果最好,2 ,42D 的效果次之, IAA 的效果最差【4】。
江洪如等【5】研究表明,2 mg/ L的2 ,42D 的诱导效果优于同样浓度的NAA。
盛长忠等[12 ]也报道对南方红豆杉,2 ,42D 比NAA 更有利于愈伤组织的形成。
但也有研究表明,NAA 激素组合比2 ,42D 组合更有利于愈伤组织的诱导,在B5 培养基中添加2. 0 mg/ L NAA + 1. 0 mg/ LIAA + 0. 5 mg/ L KT ,东北红豆杉幼茎的愈伤组织诱导率可达100 %【6】。
产生上述不同结果,可能与红豆杉的品种、培养基的种类及激素之间的组合等因素有关。
由于2 ,42D 具有致癌活性,因此作为药源的红豆杉细胞培养中宜使用其它种类的激素代替。
培养方式 3. 1 细胞悬浮培养和愈伤组织相比,悬浮培养的细胞与液体培养基充分接触,养分供给充分,因而细胞生长周期短,细胞生物量增加快,是植物细胞培养主要的方式。
3. 2 固定化培养固定化培养具有可连续培养、反应效率高、易于调控等优点,成为植物细胞培养研究中的一个重要方法。
3. 3 两相法培养两相培养技术能够使产物及时转入第二相,可以防止反馈抑制或被细胞内部的分解酶将产物降解,从而提高产物的产量;通过有机相的不断回收及循环使用,有可能实现细胞的连续培养,提高培养效率。
3. 4 两步法培养细胞的快速生长与紫杉醇的大量合成并不同步进行,而且,这两过程对培养条件的要求也不一致。
因此,把红豆杉细胞培养过程分为细胞生长和红豆杉合成两个阶段,可望解决上述矛盾。
目前,虽然红豆杉细胞培养生产紫杉醇取得了很大的进展,紫杉醇生物合成途径基本清楚,细胞的生长和紫杉醇的产量已基本得到解决,有的已达到中试规模,但植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不一致性使得在培养工程中高产细胞系不能实现高产率,而且易发生遗传变异产生其他代谢产物,另外,植物细胞培养技术较复杂,对反应器要求较高,阻碍了通过细胞培养工业化生产紫杉醇的实现。
今后在高产细胞系的选育、适合植物细胞大规模培养的新型生物反应器、合成紫杉醇的代谢调控、利用现代分子生物学技术构建高产的基因工程细胞株等方面需加强研究,以早日实现红豆杉细胞培养工业化生产紫杉醇。
【1】B5培养基。
B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。
经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好，而另一些植物，在B5培养基上更适宜。
【2】MS培养基。
MS培养基是目前普遍使用的培养基。
它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。
由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。
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