江浙蝮蛇毒镇痛组分的分离纯化及其理化性质
蛇毒神经生长因子的分离纯化及鉴定
蛇毒神经生长因子的分离纯化及鉴定
刘春宇;陈洁
【期刊名称】《暨南大学学报：自然科学与医学版》
【年(卷),期】1997(018)003
【摘要】采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０、ＣＭ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ３２柱层析，从中华眼镜蛇中分离出神经生长因子（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｅｒ，ＮＧＦ）。
经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法证明所得以的ＮＧＦ为单一组分，相对分子质量约为１．３×１０＾４。
经凝胶等电聚焦电泳测得ＮＧＦ等电点ＰＩ约为７．０左右。
经ＨＰＬＣ及电泳图像分析系统测得纯度为９８％。
此ＮＧＦ等８ｄ鸡胚背
【总页数】5页(P90-94)
【作者】刘春宇;陈洁
【作者单位】暨南大学生物工程研究所;暨南大学生物工程研究所
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.9
【相关文献】
1.蛇毒神经生长因子的进一步纯化与鉴定 [J], 刘一平;潘华
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3.中华眼镜蛇毒神经生长因子分离纯化及其对坐骨神经损伤的影响 [J], 杨斌;陈敏坚;等
4.江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性 [J],
郭丽英;朱洪;周元聪
5.神经生长因子在康复医学中的应用(Ⅰ)——白眉蝮蛇乌苏里亚种蛇毒神经生长因子的分离纯化与鉴定 [J], 苏钟浦;王彦;吕永利;于频;李永明;陈子易;景毓永;孟凤云
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蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶
蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶摘要】目的:从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。
方法:采用离子交换和亲和层析技术进行纯化。
结果:从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有精氨酸酯酶活性。
粗毒经提纯,比活可达800u/g以上,远远高于哺乳动物来源的激肽原酶,纯度可达95%以上。
对其性质考察,r为38000,n-末端的15个氨基酸序列分析表明,该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽释放酶同源。
结论:这种方法适合于工业化生产。
【关键词】江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶自从有人在美洲矛头蝮蛇(bthrpsjararaa)蛇毒中发现激肽原酶后,蛇毒激肽原酶越来越受到广大学者的重视［1］。
我国蛇类资源丰富,但受提纯工艺的限制,至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。
我们采用离子交换和亲和层析技术,从江浙蝮蛇（agkistrdnhalyspallas）蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶,并对其性质进行了研究。
1材料和方法1.1材料江浙蝮蛇蛇毒冻干粉（辽宁省清源县）,deae-sepharse,琼脂糖凝胶（瑞典pharaia公司）,苯甲酰精氨酸乙酯（baee）,对甲苯磺酰精氨酸甲酯（tae）,标准蛋白,激肽原,激肽等底物（siga公司）,低压型高效液相色谱仪（日本岛津公司）,8823b紫外检测仪（北京宾达英创科技有限公司）,balb/小鼠（7周龄）由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。
1.2方法1.2.1蛇毒激肽原酶的分离纯化（1）deae-sepharse离子交换色谱:称取江浙蝮蛇毒15g,用0.02l/lph7.8的tris-hl缓冲液溶解,以4000r/in离心20in,取上清,透析12h后,以6.0l/in的流速上阴离子交换柱（deae-sepharse）,上样完毕后以0.02l/lph7.8的tris-hl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。
药理学论文：尖吻蝮蛇蛇毒蛇毒组分分离纯化加热减毒免疫原性生物毒性碱性磷酸酶协同作用
药理学论文：尖吻蝮蛇蛇毒蛇毒组分分离纯化加热减毒免疫原性生物毒性碱性磷酸酶协同作用【中文摘要】背景:血清疗法是治疗被尖吻蝮蛇咬伤患者严重症状的最主要方法。
目前国内生产和供应的抗尖吻蝮蛇血清制品主要有三种类型:上海生物制品研究所生产的液状抗蛇毒血清,成都军区疾病预防与控制中心生产的冻干抗蛇毒血清粉剂,台北国立预防医学研究所生产的抗蛇毒血清冻干粉。
临床应用的抗尖吻蝮蛇蛇毒血清是通过用甲醛或戊二醛脱毒后的尖吻蝮蛇粗毒免疫动物(马或骡)来制备的。
虽然用甲醛或戊二醛处理的原毒能使免疫动物产生高低度的抗血清,但是反复用含有少量甲醛或戊二醛的溶液免疫动物不可避免地造成马的损伤。
好的蛇毒减毒方法,必须使减毒后的毒素具有较高的免疫原性和较低的毒性,并能产生高效价的抗血清。
到目前为止,已有多种蛇毒脱毒的技术被报道:Bicalho et al.用氯化碘溶液滴定原毒;Freitas和Frezard用脂质体包裹响尾蛇毒素原毒来减毒;很多学者研究用γ-射线照射毒性蛋白减毒;Saetang等人用选择性热变性来减毒。
每种技术都有它的优缺点,如用γ-射线照射会不仅有辐射伤害而且需要昂贵的仪器,脂质体包裹的工艺比较复杂。
相比之下,加热减毒是最简单的脱毒技术。
特别对于分子量小于25 k...【英文摘要】Background:Serum therapy is the primary treatment for systemic envenomation by D. acutus. Three types of D. acutus antivenom are produced and available in China:liquid antivenom from Shanghai Institute of Biological Products, lyophilized antivenom from Cheng-Du Military Area Center of Disease Prevention and Control, and lyophilized antivenom from the National Institute of Preventive Medicine, Taipei, Taiwan. Antivenom is isolated from the plasma of adult horses immunized with formaldehyde-detoxified D....【关键词】尖吻蝮蛇蛇毒蛇毒组分分离纯化加热减毒免疫原性生物毒性碱性磷酸酶协同作用【采买全文】1.3.9.9.38.8.4.8 1.3.8.1.13.7.2.1同时提供论文写作定制和论文发表服务.保过包发.【说明】本文仅为中国学术文献总库合作提供，无涉版权。
江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定的开题报告
江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的原核表达、纯化及其鉴定的开题报告一、研究背景及意义江浙短尾蝮蛇（Agkistrodon halys pallas）是中国南方常见的毒蛇之一，其毒液含有多种生物活性分子，如溶血酶、磷酸酯酶等。
其中，纤溶酶原激活剂（Fibrolase activator，FA）是一种能促进纤溶酶原（Fibrinogen）转变为纤溶酶（Fibrinolysin）的蛋白质，对蛇毒的研究及医疗领域有很重要的意义。
然而，目前对江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂的研究还较为有限。
因此，本研究将对江浙短尾蝮蛇纤溶酶原激活剂进行原核表达、纯化及其鉴定研究，以期得到更深入的了解和应用。
二、研究目的1.构建适合于江浙短尾蝮蛇FA基因的表达载体。
2.利用大肠杆菌原核表达系统进行江浙短尾蝮蛇FA的表达。
3.对表达的FA进行纯化，并对其纯度进行鉴定。
4.对纯化后的FA进行活性鉴定。
三、研究内容及方法1.基因克隆和重组表达构建从江浙短尾蝮蛇的蛇毒中提取总RNA，用反转录酶和引物进行逆转录和扩增。
将扩增产物进行电泳分离、回收，连接表达质粒载体，转化大肠杆菌进行克隆和筛选。
2.原核表达将构建好的表达质粒用化学方法转入大肠杆菌中，利用IPTG诱导表达目的基因，分别进行感受态和包涵体表达，根据细胞状态进行诱导条件的调优。
3.蛋白纯化对表达蛋白取得的细胞进行超声破碎（单向器）取得包涵体部分，离心后使用不同浓度的尿素和洗涤缓冲液进行溶解和洗涤，将包涵体溶液进行亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化。
4.鉴定FA纯度及活性对纯化得到的FA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过SDS-PAGE鉴定蛋白的分子量和纯度。
利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测FA的纯度。
最后，利用体外实验验证FA的活性。
四、预期结果本研究将构建适合于江浙短尾蝮蛇FA基因的表达载体，并利用大肠杆菌原核表达系统对FA进行表达。
通过多次纯化，提高FA的产率和纯度，并通过酶联免疫吸附试验鉴定其纯度。
浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究
Sephadex C 25( 2. 5 cm 40 cm 和1. 5 cm 30 cm) 柱层 析, 用醋酸铵梯度洗脱, 浓度0. 05~ 1. 0 mol L , pH 5. 4~ 7. 0, 收集主峰, 再过 Sephadex G 50 柱( 1. 2 cm 70 cm) , 取主峰冻干, 即得纯化的 CNT 。 2. 2 纯度测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) 法鉴定纯度[ 3] 采
[ 2] [ 6]
养殖场提供) 。丙烯酰胺系 Fluka 产品; 甲叉双丙烯 酰胺系 Serva 产品 ; CM Sephadex C 25 和 Sephadex G 50 均为 Pharmacia 公司产品 ; Ampholine 为 L KB 公司产品 ; 标准分子量为 Sigm a 公司产品 ; 醋酸 , 醋 酸钠 , 氯化钠等均为国产分析纯; 其他试剂均为国产 分析纯。 2 实验方法与结果 2. 1 浙江眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化 用浙江产眼镜 ( Naja naja atra) 蛇毒经两次 CM
- 1
, 95% 可信限 58~ 104 g kg
[ 6]
- 1
。
用酸性电泳系统 , 分离胶总浓度为 15% , 浓 缩液总 浓度为 3% , 电极缓冲液为 pH 4. 5, 0. 35 mol L 丙氨酸 醋 酸缓冲 液, 0. 25% 考 马斯 亮兰 R 250 染 色, 7% 醋酸脱色。经 PAGE 法鉴定, 纯化后的 CNT 为一条带 , 可达到电泳纯。见图 1。
表1 CN T 对小鼠扭体次数的影响 ( n = 20, x ! s )
小鼠扭体次数 25. 0 ! 4. 6 9. 1 ! 4. 9* 16. 5 ! 5. 7*
* [ 基金项目 ] 国家自然基金资助项目 ( 30371781) [ 作者简介 ] 李范珠 ( 1964- ) , 男 , 副教授 , 主研方向 : 药物输送 系统与新剂型 , T el: ( 0571) 86613524( O ) 。
蛇毒中非成瘾性止痛剂的研究进展
[38] M atsuzak i R,Yo sh iara E,Yam ada M,et al1c DNAcloning of I X X2Bp,a heterogeneous tw o2chain an2ticoagulant p ro tein from snake venom[J]1B i ochemB i ophys R es Comm un,1996,220:38223871[39] K ini R M1A re C2type lectin related p ro teins derivedfrom by p ro teo lysis of m etallop ro teinase disintegrinp recurso r p ro teins[J]1Toxicon,1996,34:12871蛇毒中非成瘾性止痛剂的研究进展郑文果1,苑隆国2(11吉林大学生命科学学院,吉林长春 130023;21北京生物医药研究所,北京 100091) [中图分类号]R99613 [文献标识码]B [文章编号]1001-5639(2003)04-0065-06 普通止痛药(去痛片)长期滥用极易成瘾,产生耐受性。
因此,寻找新的无成瘾性止痛剂具有十分重要的意义。
蛇毒替代吗啡用于癌症晚期的镇痛已有报道。
目前,已有研究毒素的蛇种属主要有V ip era berus,C rota lus ad am an teus,C1d u rissus terrif icus,B oth rop s a lterna tus,B1cotia ra, B1j a ra racussu和N a j a na j a。
止痛有效的产品已从眼镜蛇毒(N a j a na j a)中分离得到,由于它具有更高的镇痛活性,且无成瘾性,有可能成为吗啡的重要替代品。
从V1asp is和V1am m od y tes中分离得到的戒毒素在关节炎和风湿症的治疗中也取得了满意效果。
三步柱色谱法从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶
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毒蛇毒液中活性成分的分离纯化及其作用机制研究
毒蛇毒液中活性成分的分离纯化及其作用机制研究近年来，毒蛇毒液中的活性成分越来越受到人们的关注。
因其具有强烈的生物活性和药用价值，被广泛应用于医疗、生物技术、生产等领域。
因此毒蛇毒液中活性成分的分离纯化及其作用机制研究，也成为当今生物科学研究和产业发展的热点。
一、毒蛇毒液中活性成分的分离纯化毒蛇毒液中含有大量的生物活性成分，如神经肌肉阻滞剂、凝血酶抑制剂、磷脂酶A2、拉克腺素、肌溶蛋白酶等。
这些成分可对机体产生各种不同的作用，深受生物学家和医学家的关注。
为了研究毒蛇毒液中的这些生物活性成分，首先需要将其分离纯化。
通常采用的方法包括酸性沉淀、半制备/全制备色谱和电泳等。
其中，酸性沉淀法是较为简单的分离方法，其主要原理是利用酸性条件下，毒蛇毒液中的蛋白质在沉淀后，精制后即可得到毒液的一部分。
半制备/全制备色谱法则是常用的高效分离富集方法，其基本原理是根据分子大小、电性、亲疏水性等物理化学特性对样品分离，继而得到目标活性物质。
电泳法则是一种常用的精细分离方法，可基于分子的电性和大小来分离生物分子。
相比其他方法，电泳法能够更好地分离某些小分子物质，操作简便，并且可得到纯度较高的样品。
二、毒蛇毒液中活性成分的作用机制研究毒蛇毒液中的生物活性成分对人体的作用机制是一个重要的研究领域。
这些生物活性成分主要包括神经肌肉阻滞剂、凝血酶抑制剂、磷脂酶A2、拉克腺素、肌溶蛋白酶等。
它们的作用机制各不相同，但总体上说，可以分为以下几个方面：1. 作用于神经系统毒蛇毒液中的一些成分，如神经肌肉阻滞剂和拉克腺素，在神经系统方面具有重要作用。
神经肌肉阻滞剂主要作用在突触后膜及周围膜的离子通道，抑制神经冲动的传递，从而导致肌肉无力。
拉克腺素则主要是抑制突触前神经末梢释放神经递质，导致神经传递的正常过程受到干扰，出现神经系统中毒症状。
2. 作用于凝血系统毒蛇毒液中的某些成分具有强烈的凝血酶抑制作用，如凝血酶抑制剂。
凝血酶抑制剂主要通过抑制凝血酶的活性，阻止血栓形成，从而避免出现血栓性疾病。
蛇毒素的分离纯化及其对神经系统的作用研究
蛇毒素的分离纯化及其对神经系统的作用研究蛇毒素是一种具有强烈毒性的神经毒素，主要存在于蛇类的毒液中。
蛇毒素的主要作用是影响神经递质的释放和再吸收，从而导致人体的神经系统受到损害。
因此，对蛇毒素的分离纯化和对其对神经系统的作用研究是十分重要的。
蛇毒素的分离纯化蛇毒素的分离纯化是通过对蛇毒液中的毒素进行分离纯化，以得到纯度较高的蛇毒素。
该过程一般包括提取、分离、纯化等环节。
提取：根据不同的蛇种和毒液中的成分不同，提取方法也有所差异。
一般采用调节pH值或添加一定量的盐酸或醋酸等方法，将毒蛋白质从毒液中分离出来。
分离：将提取得到的蛋白质样品通过色谱分离或电泳分离等方法进行分离。
其中，尤以离子交换色谱法和分子筛等技术为主。
这样可以分离出不同种类的蛇毒素，例如神经肌肉毒素、神经毒素和血毒素等。
纯化：通过结晶、逆流洗脱和凝胶过滤等方法，可以进一步纯化蛇毒素。
其中，以凝胶过滤法效果最佳，因其速度快、容易掌握操作等优点。
纯化后的样品可以用于进一步的实验或制备制剂等方面。
蛇毒素对神经系统的作用蛇毒素作为一种毒素，十分危险。
其主要作用是影响神经递质的释放和再吸收。
在神经细胞和神经肌肉交界处，蛇毒素会与神经递质接头部位产生作用，阻碍神经递质与相应的受体结合。
另外，蛇毒素对神经肌肉接头部位的作用也很重要。
蛇毒素能通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱在突触间隙内积累，从而导致神经肌肉传递受到抑制。
还有一些蛇毒素直接作用于钾或钠离子通道等，影响神经肌肉兴奋性，产生药理效应。
除了对神经系统的损害作用，蛇毒素还可产生许多有益的药理效应。
例如，可以用于治疗癫痫、强直性脊柱炎等疾病。
此外，一些蛇毒素还具有镇痛和抗肿瘤的作用。
结语综上所述，蛇毒素是一种重要的生物活性物质，对神经系统的作用研究具有重要意义。
通过对蛇毒素的分离纯化和对其对神经系统的作用研究，可以帮助我们更好地了解人体神经系统的构成及其生理机制。
同时，也可为相关的临床治疗提供一定的理论基础和实验依据。
尖吻蝮蛇毒抗血小板聚集组分的分离纯化及其活性测定的开题报告
尖吻蝮蛇毒抗血小板聚集组分的分离纯化及其活性
测定的开题报告
尖嘴蝮蛇是一种常见的毒蛇，其毒液含有丰富的生物活性成分。
其中，抗血小板聚集组分是一种重要的成分，具有抑制血小板聚集、减慢血液凝固等功效。
因此，对尖嘴蝮蛇毒液中的抗血小板聚集组分进行研究具有重要的意义。
本研究旨在通过分离纯化尖嘴蝮蛇毒中的抗血小板聚集组分，并进行其活性测定，为深入研究其药理学作用提供基础数据。
具体研究内容如下：
1. 提取尖嘴蝮蛇毒液并进行初步分离
通过离心、超声波破碎等方法，提取尖嘴蝮蛇毒液。
随后，采用分子筛层析、离子交换层析等方法，对尖嘴蝮蛇毒液进行初步分离，筛选出含有抗血小板聚集组分的组分。
2. 抗血小板聚集组分的纯化
在初步分离的基础上，根据抗血小板聚集组分的特性，采用凝胶过滤层析、亲和层析等方法对其进行进一步纯化，获得高纯度的抗血小板聚集组分。
3. 抗血小板聚集组分的活性测定
采用血小板聚集试验、凝血时间测定等方法，对纯化后的抗血小板聚集组分进行活性测定，确定其抗血小板聚集和减缓血液凝固的能力。
通过以上研究，可以获得高纯度的尖嘴蝮蛇毒液中的抗血小板聚集组分，并对其药理学作用进行深入探究，为进一步开发其药用价值提供依据。
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江浙蝮蛇毒镇痛组分的分离纯化及其理化性质叶勇1*,姚广涛2,王泽时2(1.华南理工大学化工与能源学院制药工程系,广东广州510640;2.浙江中医学院药学系,浙江杭州310053)摘要:目的分离筛选江浙蝮蛇毒中主要镇痛组分,研究其分子量、等电点、纯度、氨基酸序列、稳定性等理化性质,以及镇痛作用、机体耐受性和依赖性等药理学性质。
方法采用离子交换和分子筛,以柱层析法分离蛇毒组分。
用生化测定方法,测定其理化性质。
用热板法和醋酸扭体法等确定最佳镇痛组分,并用纳洛酮催促和自然戒断实验、耐受性实验考察其依赖性和耐受性。
结果分离获得14个蛋白组分,经ED50/LD50筛选出最佳镇痛组分C4,鉴定结果表明纯度为电泳纯,HPLC相对纯度为92.16%,分子量16.6ku,等电点8.8,氨基酸序列与磷脂酶A2同源,为一种新的镇痛蛋白,并获得其紫外吸收特征峰、镇痛耐受和依赖性等性质。
结论C4组分具有显著的镇痛效果,未发现耐受性和依赖性,值得进一步研究开发。
关键词:蛇毒液类;江浙蝮蛇;镇痛中图分类号:R996.3文献标识码:A文章编号:1000-3002(2004)06-0453-07蛇毒性温味甘有毒,具有驱风攻毒、活血通络的功效。
单取蛇毒作为药用,约有70年的历史。
眼镜蛇毒的镇痛作用已明确为神经毒素的作用,但有关蝮蛇毒的镇痛组分及其理化性质的研究报道较少。
本研究以AKTA-explorer蛋白快速纯化系统对蛇毒进行分离,通过多级分离与条件优化,筛选最佳分离方法。
并通过镇痛实验方法对各组分的镇痛效价进收稿日期:2003-02-23接受日期:2004-09-27作者简介:叶勇(1969-),男,安徽省宁国人,助理研究员,医学博士,主要从事中药分离及药理学研究;姚广涛(1969-),男,河南省开封人,医学博士,主要从事中药药理学研究;王泽时(1934-),男,浙江省义乌人,教授,主要从事肿瘤临床研究。
*联系作者E-mail:yeyong2001@ Tel:(020) 33830395Fax:(020)87111884行筛选,对最佳镇痛组分进行分子量、等电点、UV光谱、氨基酸序列等理化性质测定,并对其自身依赖性和耐受性进行研究,找出江浙蝮蛇毒中具有镇痛活性的组分。
1材料与方法1.1原药材江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)采自浙江义乌地区,9~10月份收集毒液,经冷冻干燥获得乳黄色晶状固体,为江浙蝮蛇毒。
1.2动物、药品和试剂SD大鼠100只,体重220~250g;昆明种小鼠1500只,体重20~24g,雌雄各半,均由浙江中医学院动物实验中心提供。
丙烯酰胺(acryla mide), Canalab公司;N,N c-亚甲叉丙烯酰胺(N,N c-methy-lene bisacrylamide),Fluka AG公司;十二烷基硫酸钠(SDS),N,N,N c,N c-四甲基乙二胺(TE MED),Gibco-BRL公司;过硫酸铵(APS),三羟甲基氨甲烷(Tris), Sigma公司;两性电解质(ampholine),LKB公司;考马斯亮蓝G-250;醋酸;磷酸;标准蛋白质为Sigma公司购买的低分子量蛋白质,分子量分别为14.4,20.1, 31.0,43.0,66.2ku;乙腈,微滤(millipore)水,三氟乙酸,此3种试剂为色谱纯。
生理盐水(浙江平湖莎普爱思制药有限公司);盐酸吗啡(morphine chloride)注射液,沈阳第一制药厂,批号991208;盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride)注射液,北京四环制药厂,批号000822。
1.3仪器AKTA-explorer100蛋白纯化仪(Pharmacia公司,瑞典,配置AKTA-explorer蛋白快速纯化系统),检测器为全波段紫外检测器,电导检测器,pH检测器,配置Frac-900分步收集器,0.45L m滤膜,样品过滤器。
LG-5真空冷冻干燥机,DL-8R冷冻离心机(上海离心机厂),BS200S电子分析天平(意大利Sartorius)。
Hitrp TM SPXL强阳离子交换柱(1mL),Hitrp TM QFF强#453#中国药理学与毒理学杂志Chin J Pha rmacol Toxicol 2004年12月;2004Dec;18(6):453-45918(6):453-459阳离子交换柱(1mL),SQ 强阳离子交换柱(1c m @20cm),C M -Sephadex25弱阳离子交换柱,Hitrp TM HQXL 强阴离子交换柱(1mL),Hitrp T MDE AE 弱阴离子交换柱(1mL),Superdex TM 75(1cm @100c m ),Superdex T M 75(2.6cm @100c m),Superdex T M 30(1.6c m @60cm),Sephadex TM G -25(1cm @30c m)。
柱填料均购自Pharmacia 公司,简易玻璃柱(1cm @100c m,1cm @30cm,1cm @20cm)购自上海亚荣仪器厂。
1.4 分离纯化实验方法江浙蝮蛇毒中含有各种不同性质的蛋白质,利用其电荷性、分子量、疏水性、空间位阻等性质,选择不同的分离介质。
因此需要对这些影响因素进行综合考察。
AKTA -explorer 蛋白快速纯化系统提供了缓冲液pH 、流速、上样量、洗脱时间、盐浓度等30余种变量,利用探察Scouting 变量设置每轮需考察的变量,以分离度为考察指标,从而方便地进行分离条件的筛选。
本系统分离主要考察了柱型、分离系统方法、分离参数等因素在分离中所起的作用。
将基本分离的各组分进行镇痛效果初筛,基本确定有效后,再进一步考察它的理化性质。
1.5 镇痛半数有效剂量(ED 50)和半数致死剂量(LD 50)测定采用文献所述方法[1]如小鼠热板法、醋酸扭体法进行镇痛ED 50和LD 50测定。
分别取经过初筛痛阈在30s 内的50只小鼠,分为5组,每组10只,ip 纯化后的蛇毒组分10mL #kg -1,热板法测定1h 后的痛阈值,或在给蛇毒组分30min 后,ip 0.6%醋酸水溶液10mL #kg -1,观察记录小鼠的扭体次数,痛阈提高50%或扭体次数减少50%为有效,按Bliss 法计算ED 50。
小鼠ip 不同剂量蛇毒组分,观察24h 内小鼠死亡数,按Bliss 法计算LD 50。
1.6 理化性质测定方法以SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定分子量[2]、等电聚焦法测定等电点[3]、高效液相色谱法测定纯度[4],所用色谱条件为Sephasil Peptide C 8色谱柱,250mm @4.6mm;流动相A 为含0.065%三氟醋酸的2%乙腈溶液,B 为含0.05%三氟醋酸的乙腈;流速为1mL #min -1;检测器为W ATERS 紫外检测器,检测波长为280nm;进样量为20L L;数据运行时间为30min 。
并进行全波长扫描,采用Edman 降解法进行蛇毒组分的氨基酸序列测定[5]。
1.7 蛇毒组分的依赖性和耐受性实验方法采用文献所述方法[6]进行大鼠催促戒断实验、大鼠自然戒断实验和小鼠耐受性实验。
催促戒断实验:将大鼠随机分为5组,每组10只。
分别im 蛇毒组分1,2和4mg #kg -1,每天3次,连续给药7d 。
另设吗啡阳性对照组,以剂量递增法形成吗啡依赖性,吗啡每天3次sc(8:30,14:30,20:30),每次5,10,15,20,25,30,35mg #kg -1各1d 。
d 8早上末次给药后2h,ip 纳洛酮2mg #kg -1催促,观察大鼠的戒断症状。
记录齿颤、吞咽、站立、跳跃、湿狗样抖、伸展、清理皮毛的次数,对上睑下垂、流涎、腹泻等症状按照Wei [7]戒断症状评分标准评定。
自然戒断实验:大鼠分组给药同催促戒断实验,恒量连续给药21d 。
吗啡对照组第1周剂量同催促戒断,从d 8起,剂量递增为10,11和12mg #kg -1各3d,16mg #kg -15d 。
d 22各组大鼠均停药观察7d,每天称体重。
耐受性实验:取小鼠30只,随机分3组。
蛇毒组分组每日4mg #kg -1,im,阳性对照组每日im 吗啡10mg #kg -1,阴性对照组每日im 相同体积的生理盐水。
每天用甩尾法测定各组注射前基础痛阈及注射后45min 痛阈,连续7d,观察各组给药前后痛阈的变化。
1.8 统计学处理结果表示为 x ?s ,组间检验采用t 检验,组内检验采用同组配对t 检验。
LD 50和ED 50采用Bliss 法计算,结果以ED 50(LD 50)?95%平均可信限表示。
2 结果2.1 不同分离介质分离效果比较江浙蝮蛇毒的蛋白组分分离时,通过阳离子交换柱Hitrp TM SPXL,Hitrp T M QFF,SQ,C M -Sepadex 25,阴离子交换柱Hitrp TM HQXL,Hitrp TM DE AE 以及分子筛柱Superdex 30,Superdex 75对比,发现单用一种分离介质,并不能完全将蝮蛇毒中的组分分开,而采用三步分离法,即先用离子交换柱初分离,再用两种型号分子筛续分离,可将江浙蝮蛇毒中的主要蛋白质组分分离纯化(图1)。
具体的分离方法为:第1步,用醋酸钠缓冲液pH 4.5溶解原毒配成5%的溶液,离心后取上清液,过SPXL 阳离子交换柱,以0.05~1.0mol #L -1NaCl 梯度洗脱,分离出2个峰,峰1为穿过峰,峰2为洗脱峰。
第2步,将洗脱峰经冷冻浓缩后,过Sephadex 75分子筛,分离出5个峰,分别收集,编号为C1~C5。
穿过峰部分调节pH 至8,过HQXL 阴离子交换#454#Chin J Pharmacol Toxicol 2004 Dec;18(6)Fig 1. Chromatographs of purification from venom of Agkistrodon halys Pallas.Step 1:crude venom separated by co-lumn HitrpTM SPXL.Step 2:the second peak from step 1further separated by colu mn Superdex 75to 5peaks,C1-C5.Step 3:the fourth peak (C4)from step 2further puri fied by colu mn Superdex30.Fig 2. 14fractions from venom of Agkistrodon halys Pallas.C1-C5:the eluted peak from cation exchange colu mn Hi trp TMSPXL further separated by column superdex 75.A1-A5:the eluted peak from anion exchange column Hitrp TM HQXL further separated by co-lumn Superdex 75.N1-N5:the washed peak from Hitrp TM SPXL and Hi trp TM HQXL further separated by column Superdex 75.柱,NaCl 梯度洗脱,又获得穿过峰和洗脱峰,洗脱峰经冷冻浓缩后,过Sephade x 75分子筛,分离出5个峰,编号为A1~A5;穿过峰则直接过Sephadex 75分子筛,分离出4个峰,编号为N1~N4(图2)。