2014凋亡细胞的诱导及检测--LX
08实验八+细胞凋亡的诱导和细胞凋
（2）高浓度盐Ca2+的处理：
100nmol/L或500nmol/L的CaCl2或NaCl处理洋葱 内表皮8h左右； 48h后用改良苯酚品红染液染 色30min，清洗；镜检。
三、材料和试剂
材料：人类淋巴细胞株、洋葱内表皮 试剂：100μmol/L cyt c的水溶液、 100nmol/L或500nmol/L的CaCl2、改良苯 酚品红染液
四、实验方法与步骤
1.取样
（1）人类淋巴细胞株的培养
（2）直接撕取洋葱内表皮细胞
2.细胞调亡的诱导 （1） cyt c处理： 共做三组样品。试验组样品要先经cyt c处 理，浓度为12.5 μmol/L，时间控制在48h左右； 正对照样品不需要处理，为正常生长的细胞； 负对照样品是将正常细胞煮沸10min，使其坏死。
五、 实验结果
形态学变化 调亡率统计
四、实验报告
设计一个刺激诱导PCD的实验。
（3）不同机械刺激的处理（温和）：
冷激、热激、振荡等
3.形态学观察 在显微镜下观察细胞形态变化，比较和描述不同调
亡诱导，诱导细胞调亡形态变化的异同点并对试验
组细胞进行调亡率统计。
计算调亡率＝（调亡细胞数/总细胞数）×100％。
在光学显微镜下照相（数码互动显微镜）。
4.DNA电泳（梯状DNA）
实验八 细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的 形态特征的观察
一、实验目的
了解细胞调亡的原理；
掌握用于细胞调亡检测的常规方法。
二、实验原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可 分为两种类型：细胞坏死和细胞程序性死亡 （PCD），也称细胞调亡。 细胞程序性死亡分为两类：受体介导的细胞程 序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。 调亡细胞的形态学观察：HE染色、Giemsa染色、 台盼蓝染色、改良苯酚品红染色；细胞调亡生 化特征的检测：DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光 显示、调亡细胞原位末端标记法。
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂激素地塞米松T细胞细胞因子IL—2 胸腺细胞TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞IL—10 髓样白血病细胞IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞抗IgD抗体B细胞抗HLA—II抗体静止B细胞超抗原SPE CD4+T细胞胞内信号分子调节剂放线菌酮T细胞PKC激活剂胸腺细胞其他DNA拓扑异构酶抑制剂白血病细胞放射线淋巴样细胞抑制剂细胞因子IL—2 T H1细胞IL—4 T H2细胞IL—10 B、T细胞IFN—ΥT细胞IL—4 B细胞黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞VLA—4、VCAM—1 B细胞胞内信号分子调节剂PKC激活剂T、B细胞细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。
1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。
近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。
细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化：细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段：1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。
2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。
最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。
3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。
上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。
2．细胞凋亡的生化改变：1）胞内Ca2+浓度增高所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。
2）内源性核酸内切酶激活细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤
细胞凋亡检测步骤一般包括以下几个步骤：
1. 收集细胞样品：收集需要检测凋亡的细胞样品，可以是培养细胞、动物组织或人体组织。
样品应保持新鲜和完整。
2. 处理细胞样品：根据实验需要，对细胞样品进行处理，例如给予某种刺激物或药物，或者采用特殊培养条件。
3. 准备细胞悬液：将处理后的细胞样品转移到离心管中，并加入适量的培养基或缓冲液，制备细胞悬液。
悬液中细胞应保持单细胞状态。
4. 染色：根据实验要求，选择适当的染料对细胞进行染色。
常用的凋亡染色方法包括荧光染色和酶标法。
5. 流式细胞仪检测：将染色后的细胞悬液通过流式细胞仪进行检测。
流式细胞仪可以检测和分析细胞中的荧光强度或酶标信号，进而评估细胞凋亡程度。
6. 数据分析：根据流式细胞仪检测到的数据，进行数据分析，计算细胞凋亡率或凋亡指数等参数。
08细胞凋亡的诱导及观察
08细胞凋亡的诱导及观察
细胞凋亡是指细胞在细胞生存期内，在不受免疫系统的干预的情况下自身对其进行分解和降解的一种程序，凋亡是一种正常的生理现象，主要由细胞性质决定，这种自毁有助于清除过早的或受损的细胞，维持组织和身体的稳定状态。
诱导凋亡是一种研究细胞凋亡的一种常用方法，它能有效的评估细胞凋亡调节机制，其常用诱导剂有：促凋亡因子如TNF-α、IL-1β、FasL，及抗凋亡因子如Bcl-2等，其观察指标有细胞形态变化、凋亡指标物质的释放、DNA损伤的评估等。
1、细胞形态变化观察
细胞凋亡发生时，细胞形态显著改变，正常细胞多呈圆形，凋亡细胞则会萎缩、溶解、膨大，有凋亡体和细胞质滴落可见。
实验可以采用荧光显微镜或普通显微镜观察细胞形态变化。
2、凋亡特异性指标物质的释放
凋亡特异性指标物质如细胞色素c的释放是细胞凋亡最重要的标志，它是凋亡早期发生的，可以采用流式细胞仪和酶联免疫吸附活性测定法，快速简便的检测出细胞凋亡发生的情况。
3、DNA损伤的评估
DNA损伤是细胞凋亡的标志之一，为此可以采用一种常用的试剂盒TUNEL检测凋亡细胞中DNA的损伤情况，可以观察到受损的DNA片段，及DNA的裂解。
细胞凋亡实验报告
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测一、实验目的学习细胞凋亡诱导及检测。
二、实验原理1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学过程。
与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。
2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。
三、实验材料8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液四、实验步骤1.细胞传代（上一次实验完成）2.凋亡诱导1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。
3. 染色1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
五、实验结果与分析1.观察：实验开始前镜检：细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。
可以看到有的细胞处于裂解状态。
染色后：由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。
视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。
凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。
凋亡前期和中期的细胞较多。
很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。
而且有的细胞在正常光下观察是明显的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。
另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在一起。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代⼈们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡⽅式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增⾼，细胞肿胀，核碎裂，继⽽溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis⼀词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着⽣命⾛到了尽头，细胞到了⼀定时期会像树叶那样⾃然死亡。
凋亡是细胞在⼀定⽣理或病理条件下遵守⾃⾝程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表⾯微绒⽑消失，染⾊质凝集并呈新⽉形或块状靠近核膜边缘，继⽽核裂解，由细胞膜包裹着核碎⽚或其他细胞器形成⼩球状凋亡⼩体凸出于细胞表⾯，最后凋亡⼩体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的⽣化变化特征是核酸内切酶被激活，染⾊体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA⽚段，再进⼀步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸⽚断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素⼲扰等⽅⾯都起着关键性的作⽤。
1．细胞凋亡的检测⽅法凋亡细胞具有⼀些列不同于坏死细胞的形态特征和⽣化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制⼗分复杂，⼀般采⽤多种⽅法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析⽅法有所不同，⽅法选择依赖于具体的研究体系和研究⽬的（表？）。
表凋亡的检测⽅法（引⾃DL 斯佩克特等，2001）⽅法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存⽆限制略带主观性，但可靠Hoechst染⾊不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化⼄锭不限极快，凋亡初期可⽤，略带主观性，但可靠FACS/FSC X SSC ⾮贴壁细胞简单，须及时进⾏客观，仅能提⽰凋亡FACS/PI吸收⾮贴壁细胞简单，需及时进⾏客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋⽩V(锚定蛋⽩) 最好⾮贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并⾮所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显DNA⽚段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适⽤DNA⽚段(PI染⾊) 不限很快，低廉定量；⽤于估计凋亡程度DNA⽚段(JAM 分析) 循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能⽤于所有细胞TUNEL 不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损不限低廉，不能确定凋失快速亡，并⾮次⽣坏死前的所有细胞都适⽤caspase活化(蛋⽩酶活性) 不限中等花⽬前不能确定凋亡，但适⽤于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察⽅法：利⽤各种染⾊法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常⽤的⼀种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
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4人分组、加药（每竖排按从前到后的顺序1—8组） 每组6个孔加药，其中2个对照（PBS）
1 A 2 3 4 5 6
1
B
2
C
3
D
4
理论知识
细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞主动死亡
细胞凋亡的形态结构改变过程 .
(apoptotic bodies) 细胞皱缩—— 染色质凝集 —— 凋亡小体形成
(cell shrinkage) (chromatin亡小体形成
（1）凋亡起始
微绒毛消失，线粒体正常，
ER膨胀与质膜融合，染色质固缩、边集
微绒毛消失
染色质固缩、边集
（2）凋亡小体形成
染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。
(3) 凋亡小体被吞噬、消化
Macrophage/Phagocyte
诱导细胞凋亡的因子
5.碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测
【实验原理】 正常细胞和凋亡细胞的膜都保持了膜 的完整性，但凋亡细胞核染色质发生高度凝集和缘 化，并形成大小不同被膜包围的凋亡小体，而正常
细胞核染色质均匀分布；坏死细胞膜损伤，染色质
凝集程度远底于凋亡细胞。根据细胞膜功能完整性 和核内染色质发生凝集的特点，用荧光探针碘化丙 啶（PI）和Ho.33342双染方法可以区别凋亡细胞、 坏死细胞和正常细胞。
凋亡细胞
正常细胞
一、细胞凋亡的形态学特征
apoptosis
necrosis
细胞膨胀、ER、Mi、核肿胀 溶酶体膜破坏 细胞溶解
细胞变圆、微绒毛消 失、膜皱缩胞质浓缩， ER扩张与质膜融合， 核浓缩，染色质边集 形成凋亡小体
细胞坏死与程序性细胞死亡比较
细胞凋亡在形态学上可分为三个阶段：
1、凋亡起始
倒置相差显微镜观察
正常肝癌HepG2细胞
形成凋亡小体
3. 吖啶橙（AO）荧光 标本制备：
漂洗 固定
（95％乙醇）
染色
封片
观察
吖啶橙（AO）荧光显示肝癌细胞凋亡小体
4. Giemsa染色
每3人一组，取出一飞片，放入小培养皿，PBS液冲 洗，甲醇固定10min，取出飞片晾干，置载玻片上， Giemsa染色5～10分钟，自来水冲洗，中性树胶封片， 镜下观察细胞凋亡情况。
聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只
能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价值，因
为在光镜下某些类型的细胞坏死（如凝固性坏 死）可与细胞凋亡的形态相似。
凋亡小体
普通光学显微镜观察
染色质新月形边集（HE染色）
凋亡小体（HE染色）
2.荧光显微镜
用荧光染料直接对细胞DNA进行染色，或用荧光标记的特
异性探针对细胞进行标记。常用的直接用于细胞染色的荧 光染料有：DAPI、Hoechst33258和 Hoechst33342、PI、EB等。 细胞染色后色彩表现清晰，浓缩部分的荧光亮度明显增
结果
（1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的 MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解。 （2）各组OD值取均值后，以下式计算存活细胞百分数∶
存活细胞%=
OD实验组 OD对照组
×100%
（以空白组OD值调零）
对照组
实验组
细胞凋亡的 诱导及检测
山东大学医学院细胞生物学系 2014年5月
课程安排
本次融合试验共32学时，在“细胞与分子医学教 学平台”实施教学； 细胞生物学、分子生物学、遗传学三个研究所共 同承担授课，每个研究所各分配8学时，总结考 评8学时； 分组：每实验台双面6位同学为一大组，单面3位 同学为一小组。此次划定后一直到实验结束。考 评以大组为单位进行，成绩共享。 考评安排：每大组由一名同学主讲，负责分工和 答辩材料准备。地点在实验室进行。 考评内容与时间：
大蒜素
第1组
2
3
4
剂量 3ul
10ul
25ul
对照组
方法
（3）把各孔中培养基弃去，加入DMEM培养基100μ l，
于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养4h；
（细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。
（4）吸弃培养液，各孔加入100μ l DMSO，将培养板 振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过 与对照组比较得到实验组的存活率。
第一部分
培养细胞凋亡的诱导
凋亡细胞形态学观察
细胞增殖活力检查
◆凋亡诱导：
肝癌细胞HepG2 （1）培养液：10%小牛血清 高糖DMEM;
培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱
（2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔 板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60µg/ml）， 以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养1h；
◆物理性因子：包括射线（紫外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 ◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA
和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿
瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等
二、细胞凋亡的形态学检测方法
1. 倒置相差显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩
（药物、紫外线等）
显微结构
超微结构
流式细胞 检测法
四、实验操作方法与步骤
1.凋亡诱导： 2. 光学显微镜观察
观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固 缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一 般只能作为细胞凋亡的推测，不具有诊断价 值，因为在光镜 下某些类型的细胞坏死 （如凝固性坏死）可与细胞凋亡的形态相似。
正常细胞
凋亡细胞
6. MTT法检测细胞活力
琥珀酸脱氢酶显示
琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydiogenease) 存在于线粒体内，在有酶存在的部位，酶可 作用于底物进行脱氢，脱下的氢与四唑盐 （如：硝基蓝四唑Nitro-BT、四甲基偶氮唑 盐MTT等）作用，将氧化型的四唑还原成有 色的甲臜。
操作步骤：
（1）取出24孔培养板中的飞片置于培养皿上； （2）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （3）加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光 放置30min（纸盒、封口膜）； （PI使用浓度为50ug/ml，Ho.33342使用浓度为10ug/ml） （4）0.01M的PBS轻轻洗细胞3次，平均每次5min； （5）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片 上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气 泡，封固后荧光显微镜观察。 （6）荧光显微镜下观察： 在紫外光激发下，正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色 荧光，坏死细胞发桔红色荧光。正常肝癌细胞核荧光均匀， 而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝 色荧光的凋亡小体。
PI（碘化丙啶）是双链核酸的标记物，可嵌入双链 DNA或双链RNA中，PI不能穿过功能完整细胞膜，只能进 入膜有损伤的细胞。在紫外光或绿光激发后，坏死细胞 呈现出很强的桔红色荧光。正常细胞和凋亡细胞膜功能 完好，PI不能进入细胞，故不发红色荧光。 荧光探针Ho.33342是一种特异性DNA标记物，主要结 合于A-T碱基区，由于它的亲脂性，可以进入活细胞中 标记DNA（也可以进入死细胞），因此，对正常细胞、 凋亡细胞和坏死细胞都可以进行标记。在紫外光激发下， 正常细胞和凋亡细胞都发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞 因PI发出的强桔红色荧光而被遮盖。所以从颜色上很容 易将坏死细胞区分出来；再根据染色质凝集程度和凋亡 小体区分正常细胞与凋亡细胞。
本实验中培养细胞内琥珀酸脱氢酶，使 MTT还原成紫蓝色甲臜，二甲基亚砜可将 甲臜溶解，酶联仪测其光密度得到OD值。 通过OD值可计算不同条件下细胞的存活比 率。此法常用来测试细胞毒作用、癌细胞对 体外放射及化学药物的敏感性、或体外细胞 系筛选有效化疗药物及放射增敏剂等。
方法
设空白组、正常对照组、加药实验组（空白组 除不加细胞外、正常对照组除不加药物外其余均 与加药实验组同样处理） （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰 酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml,每 孔100μ l传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待 细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（3、10、25 ml）， 每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将培养板 放回37℃继续培养0.5h；
强。
3.激光共聚焦显微镜
4. 流式细胞仪（FCM）
◆凋亡检测技术的选择原则
一般选择2~3种检测方法,以相互印证,如形态学
方法可选择荧光或电镜,再加TUNEL、FCM、 DNA片段或caspases等方法 根据凋亡发生的时间顺序,选择适当的检测试剂 和技术
注意检测的时间
三、细胞凋亡研究方法
诱导细胞凋亡 检 测 形态学特征 生物化学特征（DNA含量及降解分析） 琼脂糖电泳法