植物细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡诱导技术的使用教程
细胞凋亡诱导技术的使用教程细胞凋亡是一种广泛应用于生物研究和药物开发领域的重要技术。
它是一种程序性细胞死亡的形式，通常由外界刺激或内源性信号引起。
本文将为您介绍使用细胞凋亡诱导技术的步骤、方法和注意事项。
第一步：选择适当的细胞凋亡诱导剂在进行细胞凋亡实验前，您需要根据实验目的和研究对象选择适当的细胞凋亡诱导剂。
常用的细胞凋亡诱导剂包括化学物质如顺铂和纤维芽细胞生长因子（FGF）等，以及光照、温度、药物等其他外界刺激。
确保所选的诱导剂具有稳定的活性和可重复性。
此外，在选择诱导剂时，还需考虑细胞类型和所需的凋亡研究重点。
第二步：确定适当的细胞系和培养条件选择适当的细胞系对于细胞凋亡实验至关重要。
不同类型的细胞对于细胞凋亡的响应可能不同，因此在开始实验之前，您应首先确认所选细胞系是否容易发生细胞凋亡。
一般来说，肿瘤细胞比正常细胞更容易发生凋亡反应。
此外，确定细胞的培养条件也是非常重要的。
不同的细胞系对培养基组分和培养条件的要求有所不同，在实验前应进行相关的优化。
第三步：优化诱导剂的浓度和处理时间在实验中，您需要确定诱导剂的最佳浓度和处理时间。
这些参数的选择应基于前期的实验数据和文献报道。
一般来说，使用较低剂量的诱导剂和较短的处理时间可以获得更为准确和可靠的实验结果，并减少不必要的细胞损失。
因此，在进行正式实验之前，先进行浓度梯度和时间梯度的预实验是非常重要的。
第四步：检测细胞凋亡的方法选择在细胞凋亡实验中，您需要选择适当的方法来检测细胞凋亡的程度。
常用的方法包括荧光染料染色、流式细胞术和电镜观察等。
荧光染料如荧光素酶染料（如Annexin V-FITC/PI染色）可用于进行早期和晚期凋亡细胞的区分，而流式细胞术则可提供关于凋亡细胞比例和细胞周期的详细信息。
根据实验需要和设备条件，选择适当的检测方法。
第五步：数据分析和实验结果解读在完成细胞凋亡实验后，您需要对结果进行合理的数据分析和解读。
根据实验所用的方法，计算并记录凋亡细胞比例、细胞周期等相关指标。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。
（2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。
（3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡实验详细步骤及说明
细胞凋亡是细胞在正常发育或应激条件下程序性死亡的过程。
为了深入了解细胞凋亡的机制和影响因素，以下是细胞凋亡实验的详细步骤及说明：
步骤一：培养细胞
1. 准备培养皿并涂覆培养基，确保培养基的成分适合所使用的细胞类型。
2. 从培养细胞的主要来源（如细胞培养库）中获取细胞。
3. 将细胞转移到培养皿中并在适当的温度和湿度下孵育。
步骤二：处理实验组
1. 将培养的细胞分为实验组和对照组。
实验组是要进行细胞凋亡诱导的组，而对照组则用于对比分析。
2. 选择适当的方法诱导细胞凋亡，例如化学诱导剂（如某种药物）或物理刺激（如辐射）。
3. 根据实验需要，在指定的时间间隔内观察细胞凋亡的现象和变化。
步骤三：检测细胞凋亡
1. 使用合适的细胞凋亡检测方法，如细胞染色和流式细胞术。
这些方法可用于分析各种细胞凋亡标志物的表达。
2. 准备相应的染色试剂或抗体，并按照说明溶解或稀释。
3. 按照实验需求，将细胞标本与染色试剂或抗体共孵育，并进行相应的分析和读数。
步骤四：数据分析与结果
1. 对实验和对照组的数据进行统计学分析，如均值和标准差计算。
2. 进一步分析和解释实验结果，评估细胞凋亡发生的程度和影响因素。
3. 根据实验结果撰写实验报告，包括方法、结果和结论，并进行讨论和对比分析。
以上是细胞凋亡实验的详细步骤及说明。
通过进行这些实验，
我们可以更好地理解细胞凋亡的机制以及可能对其产生影响的因素。
请根据具体实验的要求和细胞类型的特点，调整实验步骤和方法，
并确保实验过程中的安全性和可重复性。
细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡的诱导及检测一、实验目的1、了解细胞凋亡的诱导及检测。
2、了解细胞凋亡的机制及生物学意义。
二、实验原理细胞凋亡过程不同于坏死性死亡，其染色质断裂，细胞核破裂成裂片，细胞质浓缩，细胞体积变小，细胞膜内折，整个细胞通过起跑和发芽的方式形成一些大小不等凋亡小体，并逐渐被细胞周围的吞噬细胞吞噬。
在整个凋亡过程中，线粒体基本保持完好，细胞的内容物没有泄露，不会引起周围组织的炎症反应，凋亡的细胞核的核DNA 的断裂发生在核小体之间，因此产生的断裂DNA在电泳是会呈180至200dp整数倍大小的阶梯状条带，这是识别凋亡细胞的可靠生化特征，能诱导细胞凋亡的方法很多，在这里采用H202诱导细胞凋亡。
细胞凋亡的检测方法也很多，而形态学的观察方法更为方便，1、吖啶橙只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞，从而将细胞染成绿色而嗅化乙啶（EB）只进入死细胞，凋亡的细胞核染成橙红色，2、是一种荧光染料他可以与DNA双螺旋凹槽部分结合，可在紫外线下激发蓝光也可以用于观察凋亡的细胞。
三、实验材料1、酿酒酵母，2、荧光显微镜，3、8.8mol/LH2O2，4、AO/EB的PBS溶液5、酿酒酵母培养基，6、DAPI溶液台盼蓝四、实验步骤1、使用马铃薯培养基恒温30摄氏度，在振荡条件下培养24h再用3500rpm×10min 除去上清液，再用去离水洗涤，沉淀即湿菌体。
2、取上述酵母湿菌体，加双氧水2ml，在室温下缓慢振荡24h后加入乙醇，室温固定10min。
3、去掉乙醇，用PBS洗净。
4、染色DAPI染色法，加入500ml的PBS和50ul的DAPI的母液染色约10min置显微镜下观察。
AO/ EB染色法：取25ml上述悬浮细胞于载玻片上加入AO/ EB混合液，再从中取10ml 于载玻片上加一滴台盼蓝，染色5至10min，盖上盖玻片，放在荧光显微镜下观察。
五、实验结果DAPI：有的细胞染色均匀且表面光滑为正常细胞，有的细胞染色不均表面不光滑，核轮廓不规则，这是凋亡前期的细胞，有的细胞核固缩染色体凝聚边缘化，为凋亡中期细胞有的细胞崩解成碎片可看见颗粒状碎片，这是凋亡后期碎片。
08 细胞凋亡的诱导及观察
山东大学实验报告2018年5月28日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：细胞凋亡的诱导及观察学号：201600140055一、实验目的1.学习细胞凋亡的简史、概念和原理。
2.了解细胞凋亡的检测方法。
3.掌握诱导和形态学观察动植物细胞凋亡的基本方法。
二、实验原理1．细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，也称细胞程序性死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
2．细胞凋亡的生理意义1)维持生物体内环境的稳定；2)参与防御反应；3)胚胎发育过程中清除一些细胞。
3．细胞凋亡的检测方法●细胞凋亡的形态学检测●磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）●线粒体膜势能的（△Ψmt）检测●DNA片段化检测●TUNEL法●Caspase-3活性的检测●WB检测●凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析4．细胞凋亡的形态学检测未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜破裂、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
5．细胞凋亡的诱导因素➢物理因素：射线、热休克、冷激等。
➢化学因素：重金属离子、激素、毒素、活性氧、一氧化氮等。
➢生物因素：病毒、细菌、肿瘤坏死因子、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成抑制剂等。
6．细胞坏死细胞坏死（necrosis）被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。
植物细胞凋亡的信号途径及分子机制
植物细胞凋亡的信号途径及分子机制植物细胞凋亡是指植物细胞在生长、发育和环境压力等多种因素作用下，发生programmed cell death（PCD）的过程。
与动物细胞凋亡相比，植物细胞凋亡的研究还相对较少，但随着分子生物学和生物化学工具的不断改进，我们对植物细胞凋亡信号途径及分子机制的了解越来越深入。
一、植物细胞凋亡的信号途径1. 内源性因子信号途径：在植物发育和代谢过程中，产生的一些内源性因子诱导细胞的凋亡。
比如有机过氧化物，超氧离子和H2O2等可以通过ROS信号途径引起植物细胞凋亡。
2. 外源性因子信号途径：植物细胞可以通过感知外界环境变化，比如缺水、盐度和病原体的侵染，从而引起细胞凋亡。
其中外源性信号是通过植物细胞表面或细胞内受体来感知的。
3. 其他因素信号途径：植物细胞凋亡还可以通过内源性物质的来源和信号传递途径等其他因素来引起。
二、植物细胞凋亡的分子机制1. 保护蛋白家族的作用：在细胞的凋亡过程中，一些保护蛋白可以通过调节质膜电位、细胞质Ca2+浓度、ROS的代谢、一氧化氮和过氧化氢等物质，从而对细胞凋亡进行调控和抑制。
2. 转录因子的参与：植物细胞凋亡还可以通过转录因子等蛋白质的参与实现。
比如在植物细胞凋亡过程中，AP2蛋白可以通过增强细胞内一氧化氮的水平，从而促进细胞的凋亡。
3. 磷酸水平的调节：磷酸水平的改变也可以参与植物细胞凋亡的过程。
比如在低磷环境下，磷酸酯酶的表达会上调，从而提高细胞内磷酸水平，促进细胞的凋亡。
4. 各种激素的参与：生长素、脱落酸、角质素等多种植物激素都可以参与植物细胞凋亡的过程。
比如在植物细胞发生凋亡时，ABA的含量会上升，从而促进细胞凋亡。
总的来说，植物细胞凋亡的信号途径及分子机制非常复杂，涉及多种物质的参与。
在今后的研究中，我们需要针对不同的物质、不同的条件去具体探究其在植物细胞凋亡中的作用机制，从而更好地理解植物细胞凋亡的过程。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1．细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
表凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特等，2001）方法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存无限制略带主观性，但可靠Hoechst染色不限极快，不能贮存略带主观性，但可靠吖啶橙/溴化乙锭不限极快，不能贮存凋亡初期可用，略带主观性，但可靠FACS/FSC X SSC 非贴壁细胞简单，须及时进行客观，仅能提示凋亡FACS/PI吸收非贴壁细胞简单，需及时进行客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋白V(锚定蛋白) 最好非贴壁细胞快速简单；细胞可以被固定并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显著性的反应DNA片段（琼脂糖电泳）不限很快、低廉定性，不能确定凋亡；某些细胞不适用DNA片段(PI染色) 不限很快，低廉定量；用于估计凋亡程度DNA片段(JAM 分析) 循环细胞低廉，可分析多种类混合定量，不能确定凋亡含量；不能用于所有细胞TUNEL 不限昂贵，耗时定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价）线粒体膜电位损不限低廉，不能确定凋失快速亡，并非次生坏死前的所有细胞都适用caspase活化(蛋白酶活性) 不限中等花费，很快目前不能确定凋亡，但适用于监测器；不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征：（1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡的诱导与检测
•
• 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
• 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用 的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
• 电子显微镜观察
(扫描电镜) 正常细胞
(扫描电镜)
(透射电镜)
凋亡细胞—凋亡小体 凋亡细胞 凋亡小体
Thanks!
细胞凋亡诱导及检测
1.概述 2.细胞凋亡的过程与机制 3.凋亡与坏死的区别 4.细胞凋亡生物学意义 5.细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或 病理条件下，受内在遗传机制的控 制自动结束生命的过程。
• 概述
悉尼· 悉尼·布雷诺尔
罗伯特· 罗伯特·霍维茨
约翰· 约翰·苏尔斯顿
增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T 细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病： 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤
细 胞 凋 亡
1、细胞凋亡的形态学检测 、
• 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象， 晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的 染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
七.注意事项：
1.由于荧光会发生淬灭，加入DAPI染色后要尽 量避光 操作，在显微镜下操作时，先用可见光 找到细胞再转换到紫外光，因为紫外光对荧光的 淬灭效果比可见 光强很多。 2.实验要求阴性对照，不然说明不了问题。 3.每一个步骤都要PBS溶液洗掉上一步的试剂， 避免 影响下一步。 4.EB为强染色剂，使用实应高度注意。 5.在显微镜下观察时候要操作迅速因为细胞会 变干而发生改变。