病毒的分离与鉴定-实验课
海兰褐蛋鸡痘病毒的分离与鉴定
烂 ，肺 脏 出血 。收集 病变 明显 的肝、脾 、肺组 织作 为病
原 分 离 的 病料 。
１ ． ２ 材料与试剂
９ － １ ２ 日龄Ｓ Ｐ Ｆ 鸡胚购 自山东省济南市家
禽 研 究 所 ，健 康 成 年 蛋 鸡 为 本 实 验 室 饲 养 ，未 接 种 任 何
病毒。抗生素（ 注射用青 霉素钠、注射用硫酸链霉 素） 购白
色 青 白 ， 津 液 稀 少 。 粪 稀 ， 食 欲 、 反 刍 减 少 或 废 绝 ， 尿
此步 骤一 次 。取 上清约 ３ ０ ０ ｕ ｌ ￣ Ｊ Ｉ ｌ 入２ 倍体积 的无 水 乙醇混
种疾病中 ，所 以在治疗 时当审症 求因，治其根 本，本愈则
Ａ ＡＣ Ｃ Ｔ， 下游 引 物 ：ＧＴ ＧＣ ＣＴ Ａ Ｔ Ｇ ＧＡＡ Ｔ Ｃ Ｔ ＧＧ Ｔ。 （ ２ ）
断增长 趋势 并伴有零 星死亡 。剖 检病鸡 可见肝 脏 出血 ，
胰 脏 萎 缩 ，脾 脏 表 面 有 大 小 不 等 的 坏 死 点 ， 喉 头 有 黄 色 渗 出物 ： 腺 胃 肿 大 ， 腺 胃 乳 头 出 血 ， 肌 胃 角 质 层 出 现 糜
毛尿囊膜（ Ｃ Ａ Ｍ） ，采用侧面“ 开天窗” 法 ，共接种 １ ５ 枚 ，每 胚接种０ ． ２ ｍｌ ；同时设置６ 枚接种等量生理盐水作为对照 。 连续 观察 一周 ，观察胚 的死亡情 况及 死亡鸡 胚绒 毛尿囊 膜变化 ，弃去２ ４ ｈ 以 内的死亡鸡胚 ，收取死亡 和未死鸡胚
的绒 毛尿 囊 膜 。 将 绒 毛 尿 囊膜 病 料 处 理 ， 继 续 接 种 ９ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ 鸡 胚 ，盲 传 ３ 代。
鸽副黏病毒1型的分离与鉴定
多省份 都有该 病 的报 道并 分离 到病 毒 。
２０ ０ ６年 ， 鸽 场 鸽 群 拉 黄 绿 色 水 样 粪 ， 门 周 某 肛
和至 １ ０ｈ 死胚 。取 尿 囊 液进 行 血 凝 试 验 （ ２ 未 ＨＡ） ，
未 出现血凝 者 ， 传 ３ 。同时 接种 Ｆ ８ ９ 、 ９ 盲 代 ４Ｅ 株 Ｎ７ 围粘有 绿粪 ， 羽毛 蓬 松 ， 欲 减 退 或 废 绝 ， 数 鸽 头 株作 为对照试 验 。 食 少 颈扭 曲 ， 剖检 病 死鸽 。剖 检 病 死鸽 ， 见 鼻 、 管 黏 １３ ２ 效价 测 定 按 常规 方 法 测定 鸡 胚 尿囊 液 的 可 气 ＿． 膜充血 ， 的布满大 小不 等 的出血 点 ， 有 胃及小 肠黏 膜 ＨＡ 效价 。 充血 或点状 出血 ， 肠 扁桃体 肿 大 、 盲 出血 。神 经症 状 １３ ３ 血 凝抑 制试 验 将 ＨＡ 试 验 中呈 阳性 的尿 ＿． 的病 鸽 ， 以上剖 检 变 化 外 ， 除 可见 大 脑 、 脑 严 重 出 小 囊 液分别 用新 城 疫 、 流 感 （ 、 、 ） 禽 Ｈ５ Ｈ７ Ｈ９ 阳性 血清
农业 科学 院 哈 尔 滨 兽 医 研 究 所 ； 城 疫 Ｆ ８ ９株 、 新 ４Ｅ
１ ４ 病 毒 的理化 特性 测定 ． 参 照文献 ［ ］ 法 进行 理 化 特性 血 凝 素 热稳 定 ２方 性、 氯仿 敏感 性 、 乙醚敏感 性 、 耐酸 性 、 胰酶 敏感 性及
甲醛灭 活试 验的测 定 。
关键 词 ： 副黏 病毒 １型 ； 离； 定 ； 鸽 分 鉴 鸽
中 图 分 类号 ：８ ２ ６ ９ ５￥ ５ ． ９ Ｓ ５． ５ ． ；８ ８ ３ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７５ ３ （ ０ ８０ —０ ４０ １０ —０ ８２ ０ ） ７０ ４—３
禽流感病毒的分离与鉴定研究
禽流感病毒的分离与鉴定研究禽流感是一种由禽流感病毒引起的急性传染病。
该病毒主要影响禽类，但也有可能感染人类，并且一旦发生大规模爆发，将对畜牧业、禽类养殖业以及全球经济造成重大影响。
因此，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究至关重要。
分离方法禽流感病毒分离最常用的方法是直接病毒分离法和传代病毒分离法。
直接病毒分离法是将采集来的样品（充气囊液、肠道、气管、内脏等）进行磨碎、过筛后，加入细胞培养基中，通过激活剂或其他手段激发细胞后将病毒从培养基中筛选出来。
传代病毒分离法是将直接病毒分离法筛选出来的病毒，在细胞培养基中通过不断传代，逐渐升高病毒浓度，获得目标病毒菌株。
鉴定方法病毒鉴定是确定所分离的病毒种类的一系列实验。
鉴定方法包括：病理学观察、抗原鉴定和核酸检测。
病理学观察法通常采用组织学、细胞学等方法观察病毒的组织病变和病变情况，以及确定细胞的形态变化和能力损失情况。
抗原鉴定法通过病毒对特异性抗体和特异性酶的反应来鉴定病毒的类型。
常用的抗原鉴定法有酶联免疫吸附试验、荧光免疫分析法、放射免疫分析法等。
核酸检测法是通过核酸杂交技术、PCR扩增和序列分析等方法来鉴定病毒。
其中，PCR扩增技术是最常用的方法之一。
PCR扩增技术可以选择病毒特异性的保守区域，扩增出目标片段，用于比对成果，确认病毒的种类和亚型。
研究进展目前，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究已经取得了一定的进展。
例如，利用新一代测序技术，成功对H9N2亚型进行了全基因组测序和比对，揭示了其与其他亚型的基因组演化关系；同时，也研制出了多种疫苗和抗体，为禽流感的预防和治疗提供了有力的手段。
但是，禽流感病毒的分离与鉴定研究依然存在一些问题，如病毒分离效率低、鉴定方法繁琐、检测灵敏度低等。
为了进一步提高病毒分离和鉴定的精度和效率，需要加强技术研发和人才培养。
总之，禽流感病毒的分离与鉴定研究是保障人民生命健康和畜牧业发展的重要科学问题。
虽然已取得了一定的进展，但研究仍然任重道远，需要继续深入推进。
〖医学〗流感病毒的分离鉴定
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史
病毒的分离培养标准操作规程
病毒的分离培养标准操作规程1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。
2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE3．操作程序与方法：3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。
采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。
长途运输应用冰盒或4℃低温保存。
3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。
3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。
禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。
3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化；3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。
3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。
3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞或鸡胚验证病毒特异性。
或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。
4.注意事项4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。
4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定随着时间的推移，社会和科技都在不断进步，但是人类和动物之间的生病依旧是一个有待克服的难题。
其中，非洲猪瘟病毒就是一个备受关注的话题。
非洲猪瘟是一种传染性疾病，其主要传播途径是经由活猪或者猪肉极易传染给正常健康的猪，导致肺气肿、肺炎、心包炎等严重疾病，可能导致猪的死亡。
因此，研究非洲猪瘟病毒的分离与鉴定方法是解决这个难题的关键。
非洲猪瘟病毒的分离是指将猪体内的病毒分离出来，而分离病毒的方法又可以分为直接分离和间接分离两种。
直接分离法：直接分离是通过将病猪组织或被病原体污染的器官肝、脾、淋巴结、肾、肺等组织或体液（血、脑脊液、呕吐物、粪便、眼泪等）移植于实验动物，如绵羊、狗、猴等，通过实验动物感染研究是否具有非洲猪瘟病毒的传染性。
由于直接分离是通过移植病原体与实验动物接触而进行的，因此这种方法不仅不能直接反映出病原体的真实性质，而且过程繁琐，操作复杂，不适用于大规模检测。
间接分离法：间接分离是通过特异性试剂检测经过滤处理的被污染样品，从样品中寻找病原体。
常见的间接分离方法包括RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等。
其中RT-PCR是通过从猪血清、猪散污、淋巴液或组织中提取RNA，然后转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后检测特异性长度的DNA条带，确认是否为非洲猪瘟病毒。
该方法高灵敏、高特异性，可以在较短时间内获得精确的病原学检测结果。
除了分离非洲猪瘟病毒，病毒的鉴定同样需要一定的技术手段。
在鉴定非洲猪瘟病毒的过程中，最常用的手段是基因测序和分子生物学。
基因测序：基因测序可以识别和定位病毒基因组中的每一个功能基因和突变点，从而揭示病毒的演化和流行特征。
通过分析基因序列信息，确定病毒所含有的基因序列、编码蛋白质序列，从而比较不同品系之间或同一品系的病毒变异程度和遗传关系。
分子生物学：该方法主要是通过PCR技术进行检测，具有快速、灵敏、准确、特异等特点。
另外，该方法还可与特异性探针结合使用，提高标本中病毒的检测率，同时还可以通过PCR-RFLP技术检测病原体的分型，建立病毒分型数据库。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。
1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。
所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。
细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。
原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。
原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。
因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。
二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。
二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。
二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
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鸡胚尿囊腔接种法
实验材料： (1)来亨鸡受精卵、卵架、检卵灯。 (2)碘酒、酒精消毒棉球。 (3)灭菌的手术刀、镊子、剪刀。 (4)1ml注射器及针头。 (5)病毒液:流感病毒、新城鸡瘟病毒。 (6)无菌胶布。
分离鉴定程序 病人急性期咽喉含漱液 (经双抗处理) 鸡胚培养(羊水囊或尿囊腔) 35℃ ，72h 收获：取羊水或尿囊液作血凝试验 (+) (—) 作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为 阴性时报告阴性
实 验 九
病毒的分离与鉴定（一）
1、病毒的培养与鉴定 2、病毒的CPE过程 3、病毒的电镜照片观察 4、流感病毒的分离鉴定（一） （1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内 接种
流感病毒的分离鉴定
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种 目的：熟悉人工培养病毒的常用方法及其操 作技术。
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室
界线,于胚胎附近无大
血管处画出标记作为
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注射入口.
(2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀 尖在标记处打一小孔.
实验方法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育.
(5)每日在灯下检视鸡
胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml.
(4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果:
接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.