病毒分离鉴定技术
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定随着时间的推移，社会和科技都在不断进步，但是人类和动物之间的生病依旧是一个有待克服的难题。
其中，非洲猪瘟病毒就是一个备受关注的话题。
非洲猪瘟是一种传染性疾病，其主要传播途径是经由活猪或者猪肉极易传染给正常健康的猪，导致肺气肿、肺炎、心包炎等严重疾病，可能导致猪的死亡。
因此，研究非洲猪瘟病毒的分离与鉴定方法是解决这个难题的关键。
非洲猪瘟病毒的分离是指将猪体内的病毒分离出来，而分离病毒的方法又可以分为直接分离和间接分离两种。
直接分离法：直接分离是通过将病猪组织或被病原体污染的器官肝、脾、淋巴结、肾、肺等组织或体液（血、脑脊液、呕吐物、粪便、眼泪等）移植于实验动物，如绵羊、狗、猴等，通过实验动物感染研究是否具有非洲猪瘟病毒的传染性。
由于直接分离是通过移植病原体与实验动物接触而进行的，因此这种方法不仅不能直接反映出病原体的真实性质，而且过程繁琐，操作复杂，不适用于大规模检测。
间接分离法：间接分离是通过特异性试剂检测经过滤处理的被污染样品，从样品中寻找病原体。
常见的间接分离方法包括RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等。
其中RT-PCR是通过从猪血清、猪散污、淋巴液或组织中提取RNA，然后转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后检测特异性长度的DNA条带，确认是否为非洲猪瘟病毒。
该方法高灵敏、高特异性，可以在较短时间内获得精确的病原学检测结果。
除了分离非洲猪瘟病毒，病毒的鉴定同样需要一定的技术手段。
在鉴定非洲猪瘟病毒的过程中，最常用的手段是基因测序和分子生物学。
基因测序：基因测序可以识别和定位病毒基因组中的每一个功能基因和突变点，从而揭示病毒的演化和流行特征。
通过分析基因序列信息，确定病毒所含有的基因序列、编码蛋白质序列，从而比较不同品系之间或同一品系的病毒变异程度和遗传关系。
分子生物学：该方法主要是通过PCR技术进行检测，具有快速、灵敏、准确、特异等特点。
另外，该方法还可与特异性探针结合使用，提高标本中病毒的检测率，同时还可以通过PCR-RFLP技术检测病原体的分型，建立病毒分型数据库。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
病毒分离技术操作规范
病毒分离技术操作规范==========================1. 目的--------本操作规范的目的是确保病毒分离技术能够安全有效地进行，以获取纯净的病毒样品，用于后续的研究和分析。
2. 背景--------病毒分离技术是一项重要的实验技术，用于从感染源中分离出特定的病毒。
正确操作病毒分离技术可以减少污染风险，最大程度地保留病毒的活性和纯度。
3. 设备和试剂--------3.1 设备- 生物安全柜（BSC）- 做实验的实验室- 高速离心机- 恒温培养箱- 无菌工作台3.2 试剂- 细胞培养基- 抗生素- 洗涤缓冲液- 离心管- 密封的4. 操作步骤--------4.1 准备工作1. 在正压下进入生物安全柜，穿戴个人防护装备。
2. 清洗和消毒所有需使用的设备和试剂。
3. 在生物安全柜内准备全部实验所需的试剂和设备。
4.2 细胞培养1. 从培养基中使用无菌技术获取所需的细胞。
2. 将细胞转移到含有适当培养条件的培养基中。
3. 在恒温培养箱中培养细胞至达到需求的数目。
4.3 感染细胞1. 使用合适的病毒样品对培养中的细胞进行感染。
2. 根据研究需求，控制感染的时间和病毒浓度。
4.4 收集病毒1. 在感染后的适当时间点，收集感染细胞培养基。
2. 使用离心机离心培养基，将其中的细胞沉淀和病毒浮游物分离开。
4.5 存储病毒1. 将病毒浮游物分离到密封的中。
2. 储存时保持冷藏，避免病毒样品的受损。
5. 注意事项--------- 操作过程中严格遵守生物安全操作规范，确保自身和他人的安全。
- 避免交叉感染，确保实验设备和使用的试剂都是无菌的。
- 尽可能减少研究材料的暴露时间，在合适的条件下进行操作，以保持病毒样品的纯度和活性。
参考文献--------Publication Manual of the American Psychological Association(6th Ed.). (2010). Washington, DC: American Psychological Association.。
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法近年来，肺炎支原体感染成为全球范围内的公共卫生问题。
该病原体引起的肺炎病例逐年上升，对人类健康造成了严重威胁。
为了及时诊断和治疗肺炎支原体感染，科学家们开发了一系列有效的分离和鉴定方法。
本文将对肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法进行介绍。
一、流行病学调查在分离和鉴定肺炎支原体感染的病毒之前，进行流行病学调查是十分重要的。
通过调查病例发生的地点、时间、人群等信息，可以迅速锁定病原体分布的区域和特点，为下一步的分离和鉴定提供指导。
二、病毒分离病毒分离是检测肺炎支原体感染的基础步骤，常用的方法主要有以下几种：1. 细胞培养法：将临床标本中的病原体与合适的培养基和细胞共同培养，利用病原体在细胞内生长繁殖的特性，最终将病毒分离出来。
2. 动物接种法：将临床标本中的病原体接种到实验动物体内，观察其是否出现与肺炎支原体感染相类似的症状，通过实验动物的复制，最终得到病毒分离物。
三、病毒鉴定病毒分离后，需要进行鉴定以确认其是否为肺炎支原体感染的病毒。
常用的鉴定方法主要有以下几种：1. 免疫学方法：利用免疫学技术，如免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等，对分离得到的病毒进行特异性检测和鉴定。
2. 分子生物学方法：利用PCR、实时荧光定量PCR等技术，通过分析病毒基因的特征序列，快速鉴定肺炎支原体感染的病毒。
四、抗体检测除了分离和鉴定病毒本身以外，通过检测患者体内产生的抗体，也可以对肺炎支原体感染进行诊断。
常用的抗体检测方法有血清学试验和免疫层析试验等。
五、药敏试验药敏试验可以评估肺炎支原体感染的病毒对不同抗生素的敏感性。
通过对分离的病毒进行不同抗生素的药物敏感性测试，可以指导临床医生开展合理的抗生素治疗。
六、实时监测和报告随着肺炎支原体感染的增加，实时监测和报告已成为防控的重要环节。
利用PCR等快速诊断技术，可将分离和鉴定的结果及时反馈给相关部门，以便及时采取防控措施，降低感染的传播风险。
病毒的分离培养方法
病毒的分离培养方法病毒的分离培养是研究病毒性疾病、病毒结构和功能、病毒生物学特性的重要手段。
病毒是一种非细胞微生物，无法在无细胞环境中生长和繁殖，必须依赖于寄主细胞来完成其生命周期。
因此，病毒的分离培养方法主要是利用其对特定细胞的感染能力，通过培养和增殖来获取纯净的病毒制备。
首先，病毒的分离培养需要获得感染病毒的组织或细胞，这些组织或细胞通常是患者的血液、组织样本或培养细胞。
在获得样本后，需要进行样本的处理和制备。
通常的处理方法包括离心、滤过、稀释等步骤，以去除细胞碎片、细菌等杂质，获得纯净的病毒颗粒。
其次，病毒的分离培养需要选择合适的寄主细胞进行培养。
不同的病毒对细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的细胞系。
常用的细胞系包括Vero细胞、MDCK细胞、A549细胞等。
将处理后的样本接种到寄主细胞上，让病毒感染细胞并进行增殖。
接着，病毒的分离培养需要进行病毒的纯化和扩增。
通过离心、超速离心、密度梯度离心等方法，可以将病毒颗粒从细胞碎片、蛋白质等杂质中分离出来，获得纯净的病毒制备。
然后，将纯净的病毒制备接种到新的寄主细胞中，进行扩增和增殖。
最后，病毒的分离培养需要对病毒进行鉴定和检测。
通过电镜观察病毒的形态特征，利用免疫学方法检测病毒的抗原，进行核酸检测等手段，可以对病毒进行鉴定和检测，确定其种属和特性。
总之，病毒的分离培养是一项复杂而重要的实验技术，对于病毒学研究和病毒性疾病的防控具有重要意义。
掌握病毒的分离培养方法，可以为病毒学研究提供纯净的病毒制备，为病毒性疾病的诊断和防控提供重要的实验支持。
希望本文介绍的病毒的分离培养方法对您有所帮助。
流感病毒的分离鉴定(二)
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对
照
0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
摇匀置室温60～90分钟
结果
++++ ++++ ++++ +++ ++ ++
▪ 目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。
▪ 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
(5)稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红 细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。
流感病毒血凝试验
试管号
12 3 4 5
67
8
9
10
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
边缘不整齐。
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
病毒分离鉴定
附件1 病毒分离鉴定采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。
通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等加入2扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。
37℃培养4872小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。
步骤如下1. 制备抗生素浓缩液青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL小瓶分装-20℃保存。
用时融化。
2. 取12g待检病料组织放入灭菌研钵中剪刀剪碎加入少量无菌生理盐水将其研磨匀浆再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液制成20w/v组织悬液最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液混匀后室温作用1小时以1000g离心15分钟取上清液备用。
3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层将所得细胞悬液以1000g离心10分钟再用一定量EMEM生长液含5胎牛血清无BVDV抗体56℃灭活30分钟、0.3谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL悬浮使细胞浓度为2×106/mL。
4. 9份细胞悬液与1份上清液混合接种68支含细胞玻片的莱顿氏管leighton’s或其它适宜的细胞培养瓶每管0.2mL同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。
5. 经培养24、48、72小时分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物取出细胞玻片以磷酸缓冲盐水PBS液pH7.20.01M或生理盐水洗涤2次每次5分钟用冷丙酮分析纯固定10分钟晾干采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测见附件2。
6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度判定病毒在细胞中的增殖情况若荧光较弱或为阴性应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。
临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。
接种细胞时操作程序如下取-20℃冻存全血样品臵37℃水浴融化向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞37℃吸附2小时。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定病毒是一类微小的病原体，其特点是不能自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能完成复制过程。
为了有效地控制和治疗病毒引起的疾病，研究人员需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离与鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离方法1. 细胞培养法：病毒通常寄生于宿主细胞内，通过培养宿主细胞，可以将病毒从样本中分离出来。
这种方法适用于许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒等。
2. 动物接种法：某些病毒只能在特定宿主动物中复制，通过向实验动物接种疾病样本，可以使病毒复制并分离出来。
例如，用小鼠进行实验可以分离出小鼠肝炎病毒等。
3. 组织切片法：对于某些病毒，它们会引起组织的明显病变，此时可以取得感染组织的切片进行病毒分离。
例如，用患病动物的脑组织切片进行病毒分离，可用于研究狂犬病病毒等。
二、病毒的鉴定方法1. 电镜观察法：电子显微镜（TEM）可以观察到病毒的形态和结构特征，通过观察病毒的颗粒形状、大小、壳结构等特征，可以初步确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：根据病毒与宿主细胞之间的免疫反应，可以采用免疫学方法进行病毒鉴定。
包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以检测病毒的抗原或抗体存在。
3. 分子生物学方法：利用PCR（聚合酶链式反应）技术、序列分析等分子生物学方法，可以对病毒的基因组进行检测和鉴定。
这些方法对于那些无法用传统手段鉴定的病毒，如新型冠状病毒等，具有重要意义。
4. 勒芒氏法：这是一种用于病毒核酸的立体构建鉴定方法。
勒芒氏法根据病毒核酸在Denhardt液中染色的不同程度进行鉴定。
在进行病毒的分离与鉴定时，研究人员需要注意采取适当的实验室安全措施，避免交叉感染和意外暴露。
此外，病毒的分离与鉴定是一个复杂的科研过程，需要综合运用各种实验技术和方法，推动疾病防控工作的进展。
总结起来，病毒的分离与鉴定是关键的实验工作，它们为了研究病毒的性质、传播途径以及寻找有效的防治策略提供了基础性的支持。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。
其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。
1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。
目前该病已在全球范围内传播、蔓延。
我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。
国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。
河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。
从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。
1材料与方法1.1材料1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。
1.1.2细胞及血清细胞系Marc­145、Vero、PK­15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。
1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录Buffer、M­MLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ­10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RT­PCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′­CTG GAG CCG TGC TAT CAT­3′；下游引物P2 5′­TCC ATTTCA TGA CAC CTG­3′。
1.2方法1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMI­l640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMI­l640培养液。
Marc­145、Vero和PK­15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。
1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。
1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的Marc­145细胞、Vero细胞和PK­15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。
出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
1.2.4分离毒的毒价滴定(TCID50)采用微量法按参照文献[7]进行，测定其在Marc­145上的TCID50，结果按Reed­Muench氏法计算。
1.2.5病毒中和试验采用固定病毒­稀释血清法，按参照文献[7]进行，并按Reed­Muench氏法计算中和指数。
1.2.6分离毒的动物回归试验将107.5TCID50/mL HN株病毒细胞培养液经口鼻途径接种30日龄健康猪2头，3.0 mL/头，并设1头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照，隔离饲养，每日测体温，并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现，1周左右剖检观察其病变。
然后分别采集接种猪和阴性猪的肺脏、淋巴结等组织，用作PCR检测。
1.2.7RT­PCR鉴定1.2.7.1病毒基因组总RNA的提取按总RNA抽提纯化试剂盒说明提取。
1.2.7.2反转录(RT)0.8 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL 反转录buffer (5×)、2 μL：dNTP (10 mmol/L)、1.0 μL P1 (25 pmol/L)、1.0 μL P2 (2 5 pmol/L)、1.0 μL RNasin(40 U/μL)、9.2 μL 总RNA，然后置于PCR仪上65 ℃15 min后，加入M­MLV(5 U/μL) 1.0 μL，最后于42 ℃1 h，95 ℃5 min结束反应。
1.2.7.3 PCR反应 1.4 μL MgCl2(25 mmol/L)、4.0 μL buffer(10×)、0.6 μL rTaq酶(5 U/μL)、10 μL模板cDNA，置于PCR仪中扩增。
反应参数为：95℃5 min；94 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃1 min，共进行35个循环；最后72 ℃10 min。
结束后将PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2结果2.1病毒分离将过滤后的病料悬液接种于Marc­145细胞，盲传前3代未出现CPE，至第4代后开始出现规律性CPE，在24 h～36 h出现约70%的CPE。
病变特征为细胞折光性增强、变圆、膨大，部分细胞紧缩呈索状随后皱缩、脱落、形成大片空洞，与PRRSV典型CPE相符。
此毒株接种Vero细胞和PK­15细胞不出现CPE，判为阴性(图1)。
2.2PRRSV分离株TCID50测定结果按Reed­Muench法计算距离比得出TCID50结果为10­6.50/0.1 mL，即PRRSV分离株在Marc­145细胞上的增殖毒价为107.5TCID50/mL。
2.3中和试验结果按Reed­Muench法计算可知，PRRSV标准阳性血清对分离病毒株的中和效价为1∶24，即1∶24稀释的阳性血清可保护50% Marc­145细胞不产生CPE。
中和试验结果表明，PRRSV标准阳性血清能抑制该分离毒在Marc­145细胞上增殖，此分离病毒是PRRSV。
2.4动物回归试验结果将病毒细胞培养液经口鼻接种30日龄健康仔猪后2 d左右，仔猪开始出现体温升高，并出现轻度的呼吸困难、四肢末梢供氧不足、耳尖发紫等症状。
1周左右将接种猪剖检未见明显的病理变化，仅见肺部边缘有少量的出血点，有时可观察到间质性肺炎。
而对照猪则无异常变化。
2.5RT­PCR扩增和鉴定结果从分离的PRRSV分离株细胞培养物以及攻毒仔猪后所采取的肺脏、淋巴结等组织进行总RNA的提取，并用设计的针对PRRSV美洲株ORF5所设计的引物进行RT­PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，前两种材料均可扩增出720 bp大小的条带，与预期结果相符(图2)。
1.DNA 标准DL 2 000；2.病料上清悬液RT­PCR 产物；3.接种猪组织悬液RT­PCR 产物；4.对照猪组织悬液RT­PCR 产物(阴性对照)3讨论PRRS是1987年发现的一种新的猪病猪病毒病。
临床上病猪表现精神沉郁、发热、厌食及呼吸困难。
母猪流产、死胎、不孕、假孕及产出弱仔，公猪性功能下降。
目前PRRS已呈世界性分布，在我国也广泛存在。
从1996年初，我国郭宝清等首次从国内疑似PRRSV感染猪群检出PRRSV抗体并分离出PRRSV起，PRRS在我国的流行范围越来越广，血清阳性率也呈上升趋势，在我国的许多省、市(地区)已经分离到很多地方株。
PRRSV为动脉炎病毒科病毒，其有着严格的宿主范围，在常见的原代和传代细胞中不能生长，在体外培养中，能在猪原代肺泡巨噬细胞、CL2621、MA104系的克隆株Marc145生长增殖。
本试验将处理后的病料悬液接种在Marc145上连续传代后即出现明显的细胞病变，而将其接种在Vero、PK15细胞则连续传5代都不出现CPE，与有关文献报道相一致。
目前，PCR方法已被广泛应用于PRRS临床样品的检测，检测的目标通常是针对PRRSV基因组ORF7、ORF6或ORF1b。
已报道这种方法可以直接检测PRRSV感染的病猪血清、精子、流产胎儿的病理组织及感染的肺泡巨噬细胞等。
本试验根据PRRSV美洲株ORF5基因设计的一段引物，通过PCR反应能特异性扩增出PRRSV HN株的ORF5基因片段，且证明建立的RT­PCR方法完全可以检测病料中的PRRSV。
本试验从河南某猪场疑似PRRS发病仔猪的肺脏及淋巴结组织中分离到1株病毒，并进行了分离和鉴定。
根据分离病毒株致Marc­145的特征性病变、动物回归试验、毒价滴定、中和试验以及RT­PCR反应，初步判断所分离的病毒为PRRSV。
但有关该毒株的其他一些生物学特性尚待进一步鉴定。
2006年夏季，我国南方数省暴发的猪“高热病”，给养猪业带来巨大损失，安徽省也未能幸免。
现有的研究结果表明猪“高热病”为多病原混合感染及继发感染引起的，其中猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome vims，PRRSV)是主要病原。
安徽农业大学动物传染病实验室进行的流行病学调查结果也证实PRRSV为安徽猪“高热病”的主要病原之一。
在此基础上，本试验对临床疑似PRRS的病例进行病毒分离鉴定，旨在为了解安徽地区流行的PRRS毒株的生物学特性，并进一步研制相应疫苗奠定基础。
1材料与方法1．1病料采自安徽省部分疑似发生PRRS猪场发病仔猪的肺脏、脾、肾、淋巴结等组织。
1．2毒株、细胞及血清PRRSV VR-2332参考毒株、Marc-145细胞由浙江农科院惠赠；抗PRR SV猪阳性血清、阴性血清由江苏农科院惠赠；FITC羊抗猪IgG，购自北京博奥生生物技术有限公司。
1．3主要试剂及试剂盒PRRS RT．PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；PRRS抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司；DMEM培养基购自GIBC0公司；犊牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；其他常规试剂均为分析纯。
1．4细胞培养生长液为含有8％胎牛血清(NCS)、青霉素l00U／mL、链霉素l00仙g ／mL的DMEM培养液；维持液为含2％NCS，青、链霉素各100 U／mL的DMEM培养液。