病毒的分离与测定
兽医微生物学-病毒的检测
（1）间接ELISA
（2）夹心ELISA
五、分子生物学技术
3′
1、聚合酶链反应 5′
（PCR）
3′
5′
3′ 5′
5′
3′ 3′
3′ 5′ 3′ 5′
5′
模板DNA双链
3′
5′
变性
3′
5′
5′
退火
3′
5′
3′
形成新的双链 5′ DNA
3′
2、核酸杂交技术
核酸探针（probe）是指能与特定 核酸序列发生特异性互补的已知 核酸片段，可检测待检样品中特 定的基因顺序。
免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异 性与电子显微镜的高分辨力相结合，在 亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进 行定位分析的一种高度精确、灵敏的方 法。
（1）免疫凝集电镜技术
抗原与抗体凝集反应后，可使标本 中病毒颗粒聚集成团，再经负染直 接在电镜下观察，提高了敏感性， 确定病毒的血清学性质。
（2）免疫电镜定位技术
（二）病毒鉴定
1、形态学鉴定
观察CPE。常见的细胞形态学变化为细 胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞 体。有些病毒能形成包涵体。
正常细胞
病变细胞
2、 血吸附和血凝作用 多见于以出芽方式释放的病毒。 • 感染细胞具有吸附红细胞的能力 • 感染细胞的培养液中有许多游离病
毒存在，具有凝集红细胞的作用
（1）血吸附作用
（一）病毒分离的一般程序
标本采集
杀灭杂菌
（青、链霉素）
三大方法
易感动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变
接种
鉴定病毒种型 (血清学方法)
•无菌标本(脑脊液、血液)可直接接种 •器官或组织，取小块剪碎后研磨制成10～20%悬 液（内含抗生素）离心后，取上清接种； •粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前 先用抗生素处理，杀死杂菌。
禽流感病毒的分离与鉴定研究
禽流感病毒的分离与鉴定研究禽流感是一种由禽流感病毒引起的急性传染病。
该病毒主要影响禽类，但也有可能感染人类，并且一旦发生大规模爆发，将对畜牧业、禽类养殖业以及全球经济造成重大影响。
因此，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究至关重要。
分离方法禽流感病毒分离最常用的方法是直接病毒分离法和传代病毒分离法。
直接病毒分离法是将采集来的样品（充气囊液、肠道、气管、内脏等）进行磨碎、过筛后，加入细胞培养基中，通过激活剂或其他手段激发细胞后将病毒从培养基中筛选出来。
传代病毒分离法是将直接病毒分离法筛选出来的病毒，在细胞培养基中通过不断传代，逐渐升高病毒浓度，获得目标病毒菌株。
鉴定方法病毒鉴定是确定所分离的病毒种类的一系列实验。
鉴定方法包括：病理学观察、抗原鉴定和核酸检测。
病理学观察法通常采用组织学、细胞学等方法观察病毒的组织病变和病变情况，以及确定细胞的形态变化和能力损失情况。
抗原鉴定法通过病毒对特异性抗体和特异性酶的反应来鉴定病毒的类型。
常用的抗原鉴定法有酶联免疫吸附试验、荧光免疫分析法、放射免疫分析法等。
核酸检测法是通过核酸杂交技术、PCR扩增和序列分析等方法来鉴定病毒。
其中，PCR扩增技术是最常用的方法之一。
PCR扩增技术可以选择病毒特异性的保守区域，扩增出目标片段，用于比对成果，确认病毒的种类和亚型。
研究进展目前，针对禽流感病毒的分离与鉴定研究已经取得了一定的进展。
例如，利用新一代测序技术，成功对H9N2亚型进行了全基因组测序和比对，揭示了其与其他亚型的基因组演化关系；同时，也研制出了多种疫苗和抗体，为禽流感的预防和治疗提供了有力的手段。
但是，禽流感病毒的分离与鉴定研究依然存在一些问题，如病毒分离效率低、鉴定方法繁琐、检测灵敏度低等。
为了进一步提高病毒分离和鉴定的精度和效率，需要加强技术研发和人才培养。
总之，禽流感病毒的分离与鉴定研究是保障人民生命健康和畜牧业发展的重要科学问题。
虽然已取得了一定的进展，但研究仍然任重道远，需要继续深入推进。
〖医学〗流感病毒的分离鉴定
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定随着时间的推移，社会和科技都在不断进步，但是人类和动物之间的生病依旧是一个有待克服的难题。
其中，非洲猪瘟病毒就是一个备受关注的话题。
非洲猪瘟是一种传染性疾病，其主要传播途径是经由活猪或者猪肉极易传染给正常健康的猪，导致肺气肿、肺炎、心包炎等严重疾病，可能导致猪的死亡。
因此，研究非洲猪瘟病毒的分离与鉴定方法是解决这个难题的关键。
非洲猪瘟病毒的分离是指将猪体内的病毒分离出来，而分离病毒的方法又可以分为直接分离和间接分离两种。
直接分离法：直接分离是通过将病猪组织或被病原体污染的器官肝、脾、淋巴结、肾、肺等组织或体液（血、脑脊液、呕吐物、粪便、眼泪等）移植于实验动物，如绵羊、狗、猴等，通过实验动物感染研究是否具有非洲猪瘟病毒的传染性。
由于直接分离是通过移植病原体与实验动物接触而进行的，因此这种方法不仅不能直接反映出病原体的真实性质，而且过程繁琐，操作复杂，不适用于大规模检测。
间接分离法：间接分离是通过特异性试剂检测经过滤处理的被污染样品，从样品中寻找病原体。
常见的间接分离方法包括RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等。
其中RT-PCR是通过从猪血清、猪散污、淋巴液或组织中提取RNA，然后转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后检测特异性长度的DNA条带，确认是否为非洲猪瘟病毒。
该方法高灵敏、高特异性，可以在较短时间内获得精确的病原学检测结果。
除了分离非洲猪瘟病毒，病毒的鉴定同样需要一定的技术手段。
在鉴定非洲猪瘟病毒的过程中，最常用的手段是基因测序和分子生物学。
基因测序：基因测序可以识别和定位病毒基因组中的每一个功能基因和突变点，从而揭示病毒的演化和流行特征。
通过分析基因序列信息，确定病毒所含有的基因序列、编码蛋白质序列，从而比较不同品系之间或同一品系的病毒变异程度和遗传关系。
分子生物学：该方法主要是通过PCR技术进行检测，具有快速、灵敏、准确、特异等特点。
另外，该方法还可与特异性探针结合使用，提高标本中病毒的检测率，同时还可以通过PCR-RFLP技术检测病原体的分型，建立病毒分型数据库。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
病毒分离鉴定培训课件
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病毒分离鉴定
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二、病毒的分离培养
病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病 毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏 感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种） 或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
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病毒分离鉴定
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(一）动物接种法
接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。
按病毒侵袭部位不同选择适当的 接种途径。嗜神经病毒接种在小 鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹 病毒接种于家兔角膜。
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病毒分离鉴定
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三、病毒鉴定
1. 形态学鉴定
细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）
•病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。 常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或 脱落，这些改变称为细胞病变效应 （cytopathic effect，CPE）。
•CPE出现的时间也是鉴定病 毒的标志之一。
4.接种
鸡胚卵黄囊接种：用5～ 鸡胚羊膜腔接种：用 8天鸡胚，以细长针头由 12～14天鸡胚，将检 鸡卵气室端刺入卵黄囊。 材注入羊膜腔，孵育 孵 育 后 取 获 卵 黄 囊 膜 检 后取羊水检查（图7查（图7-7）。常用于某 8 ） 。 常 用 于 流 感 病 些嗜神经病毒的分离。 毒的初次分离。
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病毒分离鉴定
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细胞折光性↑，变圆○，局部→全层，死亡脱落， 如：肠道病毒
细胞病变
正常细胞
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病毒分离鉴定
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于培养单纯疱疹病毒、天
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病毒分离鉴花定 病毒和痘病毒。
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5.剖检及收获
收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚内血液 凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将 气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然 后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切 勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉 素小瓶内，于低温保存。
新城疫病毒的分离与分子生物学分析
新城疫病毒的分离与分子生物学分析新城疫病毒是一种高致死性的病毒，可引发严重的肺炎和急性呼吸道综合征。
自2002年首次在广东出现以来，已经在全球范围内导致了大量感染病例和死亡事件。
在这篇文章中，我们将讨论如何通过分离和分子生物学分析来研究和控制该病毒的传播。
分离新城疫病毒的方法主要包括病人呼吸道标本、血液和尿液等样本的采集和处理。
采集样本的过程必须要遵循一定的操作规范，以确保样本的纯度和完整性。
一旦获得样本后，需要进行初步的分离和纯化，通常采用细胞培养和血清学检测等方法。
细胞培养可以帮助检测新城疫病毒的生长和增殖情况。
以Vero细胞（一种绿猴肾细胞）为例，将样本接种在细胞上，若出现细胞变形、聚集等现象，则说明可能存在病毒污染。
除了细胞培养，还可以通过血清学检测来初步诊断新城疫病毒感染。
检测方法包括免疫荧光抗体（IFA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等。
然而，这些方法只能用于初步筛查，无法确诊新城疫病毒感染。
因此，需要进一步进行分子生物学分析，以明确是否存在新城疫病毒的感染。
分子生物学分析包括核酸检测、基因测序和病毒进化等方面。
其中核酸检测是最常用的方法，包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光PCR、基因芯片等。
这些方法依靠特异性引物或探针在样本中扩增病毒RNA或DNA并定量检测，可以快速、准确地确定新城疫病毒的感染情况。
基因测序是了解病毒的遗传特征和进化过程的重要手段。
通过对新城疫病毒的基因序列进行测定和分析，可以了解其基因型及变异特征。
此外，还可以通过比对不同病毒的基因序列，研究新城疫病毒的进化和传播规律。
例如，近年来新城疫病毒在中国境内的基因型已有较大的变异，有些甚至与在南亚和东南亚地区发现的菲律宾地鼠疫病毒比较相似，进一步增加了疫情的复杂性和危害性。
总之，通过分离和分子生物学分析，可以深入研究新城疫病毒的生物学特征、进化和传播规律，进而为预防和控制该病毒的传播提供重要的科学依据。
禽流感病毒的分离与鉴定技术
禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。
如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。
①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。
该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。
禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。
一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。
高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。
①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。
目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。
文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。
①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。
死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。
由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。
①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。
对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。
内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。
①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
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第二十九讲病毒的分离与测定
教学目的：掌握病毒效价的测定方法
教学重点：噬斑法、终点法
教学难点：病毒的分离与鉴定
课时分布：1学时
教学过程：
一、病毒的分离与纯化
1、病毒的分离
病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。
（1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。
（2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。
噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。
2、病毒纯化
通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。
（1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。
（2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。
二、病毒的测定
在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。
发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数
（1）电镜下直接计数
（2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。
此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。
但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。
总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。
2、病毒的感染性测定
测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。
病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。
病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。
（1）噬菌斑的测定
噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。
它是phage存在的一种指示性指标。
在液体培养基中培养物变清。
一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。
通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。
①双层平板法
底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固
指示菌0.2 ml、检样0.1 ml
→32℃16-24h
测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
脂的上层出现透明无菌的圆形或近圆形的噬菌斑。
该法在phage的检查和定量测定中普遍采用，常用于phage效价测定，效价=平均phage斑数×稀释倍数÷取样液量
②单层平板法
用无菌吸管各吸取指示菌、检样于灭菌培养皿中，将冷到45℃的单层培养基倒平皿，并与指示菌、检样混匀，32℃、12小时观察，也可直接将三种混合再倒平皿。
指示菌混匀32℃12h观察
检样0.1ml
该法简便、省料，但难以准确定量。
③平板点滴法
单层培养基15ml 培养3-4h长出菌落点滴 32℃6-8h 观察溶菌斑
指示菌0.2 ml
接种环沾取检样分别点菌落，有phage则会使所点菌落溶解。
该法简单、快速，可初步判断待测试样的效价。
④平板交叉划线法
检样
噬菌斑
指示菌
若有phage存在，则会在交叉处出现噬菌斑。
动物病毒的噬斑测定与噬菌体的噬菌斑测定类似，所不同的是以单层细胞代
替细菌。
植物病毒采用枯斑测定即用金刚砂破坏植物表皮与细胞壁并与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，一产生坏死斑的数目来测定病毒样品的效价。
（2）终点法
不能用噬斑法或坏死法测定的动、植物病毒可用该法定量。
方法是取等体积的经10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元（如某种动、植物、鸡胚或细胞培养）经一定时间，以实验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应所需的病毒剂量来确定病毒样品的效价称半数效应剂量，并以实验单元群体中的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒稀释液的稀释度的倒数的对数值表示。
半数效应剂量有不同的表示：半数致死剂量指使半数试验宿主死亡的病毒剂量；半数感染剂量指使半数试验宿主发生感染的病毒剂量；半数组织培养感染剂量指使半数组织培养物遭受感染发生细胞病变的病毒剂量。
三、病毒的鉴定
1、根据病毒感染的宿主范围及感染表现鉴定
2、根据病毒的理化性质鉴定
3、血细胞凝集性质鉴定许多病毒能吸附于一定种类动物的红血球细胞表面产生凝集现象。
不同病毒所凝集的血细胞种类、凝集温度、pH不同。
4、血清学鉴定
5、分子生物学学方法
3、毒粒的性质。