病毒的分离鉴定
〖医学〗流感病毒的分离鉴定
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管参加生理盐水。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL参加第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL参加第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
+－
－
－
→→ → → → → → →→
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤㈥ ㈦ ㈧ ㈨㈩
试管号 10
12 3 4 5
67
8
9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
弃0.2
病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照
不 管 是 中 医学 还是西 医学， 从二者 现有的 思维方 式的开 展趋势 来看， 均是走 向现代 系统论 思维， 中医药 学理论 与现代 科学体 系之间 具有系 统同型 性，属 于本质 相同而 描述表 达方式 不同的 两种科 学形式 。可望 在现代 系统论 思维上 实现交 融或统 一，成 为中西 医在新 的开展 水平上 实现交 融或统 一的支 撑点， 希冀籍 此能给 中医学 以至生 命科学 带来良 好的开 展机遇 ，进而 对医学 理论带 来新的 革命。 编 辑 本 段 现 代中医 史
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定
非洲猪瘟病毒的分离与鉴定随着时间的推移，社会和科技都在不断进步，但是人类和动物之间的生病依旧是一个有待克服的难题。
其中，非洲猪瘟病毒就是一个备受关注的话题。
非洲猪瘟是一种传染性疾病，其主要传播途径是经由活猪或者猪肉极易传染给正常健康的猪，导致肺气肿、肺炎、心包炎等严重疾病，可能导致猪的死亡。
因此，研究非洲猪瘟病毒的分离与鉴定方法是解决这个难题的关键。
非洲猪瘟病毒的分离是指将猪体内的病毒分离出来，而分离病毒的方法又可以分为直接分离和间接分离两种。
直接分离法：直接分离是通过将病猪组织或被病原体污染的器官肝、脾、淋巴结、肾、肺等组织或体液（血、脑脊液、呕吐物、粪便、眼泪等）移植于实验动物，如绵羊、狗、猴等，通过实验动物感染研究是否具有非洲猪瘟病毒的传染性。
由于直接分离是通过移植病原体与实验动物接触而进行的，因此这种方法不仅不能直接反映出病原体的真实性质，而且过程繁琐，操作复杂，不适用于大规模检测。
间接分离法：间接分离是通过特异性试剂检测经过滤处理的被污染样品，从样品中寻找病原体。
常见的间接分离方法包括RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等。
其中RT-PCR是通过从猪血清、猪散污、淋巴液或组织中提取RNA，然后转录为cDNA，再进行PCR扩增，最后检测特异性长度的DNA条带，确认是否为非洲猪瘟病毒。
该方法高灵敏、高特异性，可以在较短时间内获得精确的病原学检测结果。
除了分离非洲猪瘟病毒，病毒的鉴定同样需要一定的技术手段。
在鉴定非洲猪瘟病毒的过程中，最常用的手段是基因测序和分子生物学。
基因测序：基因测序可以识别和定位病毒基因组中的每一个功能基因和突变点，从而揭示病毒的演化和流行特征。
通过分析基因序列信息，确定病毒所含有的基因序列、编码蛋白质序列，从而比较不同品系之间或同一品系的病毒变异程度和遗传关系。
分子生物学：该方法主要是通过PCR技术进行检测，具有快速、灵敏、准确、特异等特点。
另外，该方法还可与特异性探针结合使用，提高标本中病毒的检测率，同时还可以通过PCR-RFLP技术检测病原体的分型，建立病毒分型数据库。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
病毒的分离鉴定
要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1.病毒的分离1.1标本的处理1。
1。
1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g,4°C离心6min.b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g4C离心30min。
c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液,3000X g4C离心30min。
1.1.2除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时。
c）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4°c过夜除菌.1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1。
2。
1鸡胚接种a）鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致.b）孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温度为38-—39C，相对湿度为40—70%,孵育8日后,鸡卵应每天翻动1-2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c）检卵：鸡卵孵育4~5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵:鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法
肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法近年来，肺炎支原体感染成为全球范围内的公共卫生问题。
该病原体引起的肺炎病例逐年上升，对人类健康造成了严重威胁。
为了及时诊断和治疗肺炎支原体感染，科学家们开发了一系列有效的分离和鉴定方法。
本文将对肺炎支原体感染的病毒分离与鉴定方法进行介绍。
一、流行病学调查在分离和鉴定肺炎支原体感染的病毒之前，进行流行病学调查是十分重要的。
通过调查病例发生的地点、时间、人群等信息，可以迅速锁定病原体分布的区域和特点，为下一步的分离和鉴定提供指导。
二、病毒分离病毒分离是检测肺炎支原体感染的基础步骤，常用的方法主要有以下几种：1. 细胞培养法：将临床标本中的病原体与合适的培养基和细胞共同培养，利用病原体在细胞内生长繁殖的特性，最终将病毒分离出来。
2. 动物接种法：将临床标本中的病原体接种到实验动物体内，观察其是否出现与肺炎支原体感染相类似的症状，通过实验动物的复制，最终得到病毒分离物。
三、病毒鉴定病毒分离后，需要进行鉴定以确认其是否为肺炎支原体感染的病毒。
常用的鉴定方法主要有以下几种：1. 免疫学方法：利用免疫学技术，如免疫荧光法、酶联免疫吸附试验等，对分离得到的病毒进行特异性检测和鉴定。
2. 分子生物学方法：利用PCR、实时荧光定量PCR等技术，通过分析病毒基因的特征序列，快速鉴定肺炎支原体感染的病毒。
四、抗体检测除了分离和鉴定病毒本身以外，通过检测患者体内产生的抗体，也可以对肺炎支原体感染进行诊断。
常用的抗体检测方法有血清学试验和免疫层析试验等。
五、药敏试验药敏试验可以评估肺炎支原体感染的病毒对不同抗生素的敏感性。
通过对分离的病毒进行不同抗生素的药物敏感性测试，可以指导临床医生开展合理的抗生素治疗。
六、实时监测和报告随着肺炎支原体感染的增加，实时监测和报告已成为防控的重要环节。
利用PCR等快速诊断技术，可将分离和鉴定的结果及时反馈给相关部门，以便及时采取防控措施，降低感染的传播风险。
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定教学目的：掌握病毒效价的测定方法教学重点：噬斑法、终点法教学难点：病毒的分离与鉴定课时分布：1学时教学过程：一、病毒的分离与纯化1、病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。
（1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。
（2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。
噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。
2、病毒纯化通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。
（1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。
（2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。
二、病毒的测定在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。
发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数（1）电镜下直接计数（2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。
此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。
但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。
总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。
2、病毒的感染性测定测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。
病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。
病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。
病毒学- 病毒的检验汇总
可直接用纯化的病毒核酸通过电镜观察，对 其进行鉴定。但技术要求较高。 近年来,PCR核酸测序技术的应用使得病毒核 酸型鉴定的可行性大为增加。 （观看PCR视频）
②脂溶性试验
用乙醚或氯仿处理待检病毒液,而后与未处理 者比较其TCID50的变化,以判断是否敏感。 乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等脂溶剂能破坏病 毒的脂质包膜。 有包膜的病毒对脂溶剂敏感,受脂溶剂的处理 能使病毒失去感染性;无包膜的病毒往往对脂 溶剂有抵抗力。因此,用乙醚等可以鉴定所分 离的病毒是否有包膜。
病毒粒的结构模式图
包膜子粒
包膜
包膜病毒
壳粒
衣壳
核衣壳
核心（核样物）
处理方法:
将病毒悬液2000~3000r/min离心20min,取上清液,分成 两组： 一组为试验组：按与乙醚4:1的比例振荡混合均匀,管口 密封好,4℃过夜后,2000~3000r/min离心20min。此时液 体分为两层,上层为乙醚,下层为病毒液。吸取下层部分, 避免混有乙醚。 另一组为对照组：不加乙醚,处理方法同试验组。 将两组的病毒液同时测定病毒滴度,如果试验组病毒滴 度明显降低,与对照组有明显差异,说明病毒对乙醚敏感, 属于有膜病毒。如果两组的病毒滴度没有显著差异,说 明病毒对乙醚有抵抗力,属于无膜病毒。
(2)病毒的生物学特性 ①细胞病变效应
哪三种现象？
病毒或接种分离标本后，细胞出现的病理性变化。 不同的病毒具有不同的敏感细胞，而又能引起不同的细 胞病变效应。 例如：上呼吸道标本接种到细胞培养上,出现细胞融合, 产生多核巨细胞现象，就要考虑副黏病毒、疱疹病毒、 肾综合征出血热病毒、冠状病毒、流感病毒等；接种到 WI-38或人胚肺细胞培养上出现散在的、局部堆积的巨 大细胞，则要考虑巨细胞病毒的可能性；肠道病毒能使 细胞圆缩、变小、分散，往往全部细胞受到破坏；腺病 毒能使细胞肿大，颗粒增多，细胞聚集成葡萄状。
鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定
动物生产 592023.6鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定于 柳（大连市金普新区动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116100） 鸭病毒性肝炎病毒是一种高致病性传染性疾病，其病程短、发病急、传播速度快、致死率高，临床症状为抽搐、痉挛、角弓反张等症状。
此病毒主要危害1月龄内的雏鸭，周龄越小死亡率越高，严重制约着养鸭业的发展。
本文对鸭病毒性肝炎病毒分离与鉴定方法进行综述，为此病的防控提供参考。
1 病毒分离与鉴定鸭病毒性肝炎病毒常用鉴定方法是分离培养病毒。
动物培养、细胞培养和鸭胚尿囊腔接种是3种病毒分离方法。
在细胞培养中，国外研究者报道此病毒可在鸭胚（鸡胚）肾细胞、鸭胚（鸡胚）成纤维细胞和鸭胚肝细胞中生长增殖。
鉴于不同毒株毒力强弱与对不同细胞适应性存在的差异，该病毒在细胞上会产生轻微病变或不发生细胞病变。
通常情况下，病毒初代分离使用鸭胚，连续传若干代之后易增殖。
死亡鸭胚的主要特征为皮肤水肿、出血、侏儒症、肝脏水肿呈绿色。
在传代中，病死率升高，死亡特征显著。
采集死胚尿囊液，采用中和试验和电镜技术等方法进行鉴定。
2 血清学方法2.1 中和试验检测鸭病毒性肝炎肝炎病毒最可靠、最经典的方法时中和试验。
此方法可在鸡胚、鸭胚、雏鸭进行固定血清—稀释病毒。
研究者发现，在56℃条件下，被检血清灭活半小时，将病毒与血清的混合液在接8日龄鸡胚前37℃水浴40分钟，检出率可明显提高。
2.2 间接血凝与血凝抑制试验间接血凝试验通过不断改进可用于检测血清中存在的各种病原抗体，与酶联免疫吸附测定相比，此方法操作简便、迅速、设备要求不高。
我国研究者将间接血凝抑制试验同中和试验进行比较，检测阳性结果符合率达85%。
2.3 乳胶凝集试验研究人员使用提纯浓缩的抗鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶建立了快速检测抗原的反向乳胶凝集试验法。
结果显示，抗体致敏乳胶未出现自凝情况、特异性强、可重复，安全可靠。
并且，通过竞争凝集的原理，采用提纯浓缩的抗Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶结合待测血清抗体，建立了乳胶凝集试验检测法，此方法对抗原纯度要求不严格，避免鸭病毒性肝炎病毒难以纯化的情况。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
数据库的建设：汇集
了大量DNA序列、蛋白 质信息
预测基因、基因产物的
结构、功能；分析基因基因、基因-产物、产物-
产物之间的相互作用或
联系；描述细胞或整体 水平的基因表达谱；推
测系统发生关系。
•NCBI数据库
NCBI首先创建GenBank数据库
•于 1991 年 开 发 了 Entrez 数 据 库 检 索 系 统 ， 该 系 统 整 合 了 GenBank、EMBL、PIR和SWISS-PROT等数据库的序列信息 以及MEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他 们有机地结合在一起 •NCBI 还 提 供 了 其 他 数 据 库 ， 包 括 在 线 人 类 孟 德 尔 遗 传 (OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人 类 基 因 序 列 集 成 （ UniGene ） 、 人 类 基 因 组 基 因 图 谱 （GMHG）、生物门类（Toxonomy） 等数据库
反转录合成cDNA
PCR扩增
直接测序或克隆测序
什么是聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由K.
Mullis于1983年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列 的相互作用。
Trans反转录酶系列
2．实时定量PCR
常用于mRNA的定量分析 实 时 定 量 PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是 定 量 分 析mRNA的最通用、最快速、 最简便的方法，该方法是对
SYBR Green PCR
2）50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定
结 晶 紫 染 色 中 性 红 染 色
（二）病毒理化性质及血清学鉴定
1）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等
3）血清学鉴定 ELISA；IFA；
（三）病毒分子生物学鉴定
阳性分离物上清
提取总RNA
3.DNA芯片技术
基因芯片工作流程
DNA芯片（DNA chip）
在固相支持物上有序固化寡
核苷酸或DNA探针，与待测 荧光标记样品进行杂交；
通过对杂交信号的检测、比
较和分析，得出样品的遗传 信息(基因序列及表达)；
亦被称作DNA微阵列(DNA
microarray)。
三、生物信息学是预测基因组结构和功 能的重要手段
组织培养分离法： 没有隐性感染 没有免疫能力的抵抗力 接种量大 培养条件易于控制 加速病毒的分离过程 汉坦病毒敏感的培养细胞 首先发现人肺癌细胞（A549） 其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等
细胞病变 （CPE ）：
1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变；
2、局灶状小颗粒 状破坏；
强调点：实验室生物安全
实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作； 在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作； 实验过程中一定要做好严格防护。
二、病毒的鉴定
（一）病毒的数量与感染性测定
1）蚀斑（plaque）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU）
PCR操作过程
PCR技术的工作原理
1、预变性（Initial denaturation）： 模板DNA
完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5 分钟；
2、引物退火（Primer annealing）：退火温度一
般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响；
3、引物延伸（Primer elongation）：引物延伸
一般在72 ℃进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定；
4、循环中的变性步骤：循环中一般95℃，30秒足
已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；
5、循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产
生非特异条带；
6、最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 ℃维持
动物的发育、活动力、食欲和粪便 特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡 有些实验还需测量动物的体温和体重
•静脉接种
2．组织培养
（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养
（3）传代细胞培养
（4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变
“全程冷链”
1．动物接种
动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄） 优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离； 缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差 异；
接种途径：
•脑内接种 •皮下接种 •皮内接种 •腹腔接种 •肌肉接种
实验动物的观察：
常用分子生物学软件
引物设计- Primer Premier5.0
PCR扩增和序列测定
序列拼接DNAStar：SeqMan BLAST-序列比对确定病原 ClustalX -序列比对 BioEdit - 综合序列分析软件
MEGA5-系统发生分析
MegAlign-相似性分析 GeneDoc-序列差异分析、保守性分析
5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双 链。
PCR的各种变体
反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RTPCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR）
1．反转录PCR
可用于mRNA的半定量分析 反 转 录 PCR (reverse transcription-PCR，RT-PCR) 是 一种简单、快捷地对RNA进行定 性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增cDNA， 再以cDNA为模板进行特定基因转 录产物的PCR扩增。RT-PCR技术 一般用于RNA的定性分析；如果 设置阳性参照，则可对待测RNA 样品进行半定量分析。 该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。
3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。
圆缩； 脱落； 聚集； 破碎；
3．鸡胚培养
优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便； 缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；
4．蚊虫分离病毒法
经口感染
胸腔接种
优点：病毒可长时间保存在蚊体内；
蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大； 缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；
病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介
云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科 冯 云 E-mail:ynfy428@ 2012.5.30
一、病毒的分离
标本的处理
病毒的分离
蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒
实监测，具有
很高的灵敏度和特异性。
*目前有5种技术用于实时定量PCR
其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加； 其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的 TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的 需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是成本较高。