犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒敦化株的分离与鉴定
中国兽医杂志
２ ０ ｌ ７ ｌ （ 筇５ ３卷 ） 筇 ９期
犬 细 小 病 毒 敦 化 株 的 分 离 与 鉴 定
任 谓 明 ，孙 铭！ ，叶 明 ， 赵 丹 ’
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采集延边州敦化市地 区疑似 犬细小病 毒感 染病犬的粪便 样 ． Ｉ 『 Ｉ ， 经过 预处理 后 步接 种猫 肾细胞 （ Ｆ ８ １ ） ， 肖传罕纠 胞Ⅲ ｌ ｛ Ｊ 】 病变， 经形 态学 、 分子生物学 、 免疫学等方法进行分析鉴定 、结 ： 分离到 的病毒 『 ｌ Ｊ 使 Ｆ ８ ｌ 细 胞 现特 性 痫 变 、 Ｉ ｕ 镜 卜ｉ ， Ｊ 见清 晰的病毒粒子 、 其培养物可使红细胞发 生凝 集 且能 被特 抖性 ｆ ｊ Ｉ １ 血 清所抑 制 、 ｌ 川特 异 ｊ Ｉ 物进 行 Ｐ Ｃ ｔ ／ 榆 洲缩 ｉ １
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犬细小病毒AT-7株的分离与鉴定
２ ０℃保 存 备 用 。
１２ ２ 犬 细 小病 毒 的 分 离 培 养 临床 样 品 病 料 上 清 液 用 滤 ．． 器 过 滤 （ 膜 孔径 为 ０ ２ ｍ） 菌 。将 长 成 单 层 的 Ｆ ８ 滤 ．２ 除 Ｋ １细
现明显 的细胞病 变； 感染 的 Ｆ １细 胞 中扩 增 出 Ｃ Ｖ基 因 的特 异 性 片段 ； 毒 液 可 凝 集 猪 红 细 胞 ， 凝 价 为 在 ８ Ｐ 病 血
１： ２ ， 凝 性 能 被 特 异性 抗 体 抑 制 。 １８ 血 关 键 词 ： 细 小 病 毒 ； 染 ；鉴 定 犬 感 中 图分 类 号 ： ８ ２６ ９ ２ ￥５ ．５ ． 文献标志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２—１０ （００）６～ ３ ３— ２ １０ ３ ２ ２ １ ０ ０６ ０
所收集病例作为材料 ， 对疑 似犬 细小病毒病 的病 犬 中进行病
毒 分 离 ， 过 同 步培 养 法 连 续 盲 传 接种 胎 猫 肾 细 胞 （ Ｋ １ 、 通 Ｆ ８ ）
Ｈ Ａ试验 、 电镜观察 、Ｃ Ｐ Ｒ检测 ， 进行病毒的分离鉴定和分型。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
１ １１ 病 料 样 品 ．．
２０ ０ ９年 ４＿ ＿ ６月 泰 州 爱 特 宠 物 医 院 出 现
１２３ １ 猪醛化红细胞 的制备 ． ．．
加枸椽 酸钠 作抗凝剂的 温 升 高 、 水 、 吐 、 出 黏 临 体 脱 呕 排 液状 或 带 血 的 稀 便 （ 血 性 肠 炎 ） 主 。 收 集 疑 似 犬 细 小 病 出 为
犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析
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［ 关键词 ］ 犬细小病毒 ；Ｐ ； Ｖ ２ 分离； 鉴定
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怎么检测狗犬瘟细小的方法
怎么检测狗犬瘟细小的方法
要检测狗犬瘟细小，可以使用以下方法：
1. 症状观察：观察狗犬是否出现典型的瘟热症状，如食欲不振、发热、咳嗽、呕吐、腹泻等。
这些都是狗犬瘟细小常见的症状。
2. 呼吸道炎症测试：使用呼吸道炎症测试工具，如PCR（聚合酶链反应）或ELISA （酶联免疫吸附测定法），这些测试可以检测狗犬体内是否存在瘟热病毒。
3. 血液测试：通过血液检测狗犬体内的抗体水平，以确定是否感染了瘟疫病毒。
常用的血液检测方法包括ELISA和免疫荧光抗体法。
4. 病毒分离和培养：从狗犬的体液中（如血液、鼻拭子等）采集样本，通过病毒分离和培养方法，在培养基上观察病毒的生长和复制情况，以确定是否存在瘟热病毒。
5. 化验检查：将狗犬瘟热病死亡的组织样本送往动物疾病监测实验室，进行病理学和病原学检测，以确定是否感染了瘟热病毒。
以上方法需要由专业的兽医或实验室人员进行操作和解读结果。
在狗犬患有瘟热病毒疑似病例时，建议及时就医和咨询专业兽医。
犬细小病毒病的诊治与防控措施
犬细小病毒病的诊治与防控措施犬细小病毒病是一种常见的犬病，由犬细小病毒引起。
该病毒主要通过犬体液、排泄物和直接接触传播，能引起犬的呼吸道、消化道、泌尿生殖系统的病变，严重时可导致犬的死亡。
以下是关于犬细小病毒病的诊断、治疗和防控措施的介绍。
一、诊断方法1.临床表现：犬细小病毒病的临床表现多种多样，包括食欲不振、呕吐、腹泻、发热、呼吸困难、咳嗽等。
粪便检测可发现病毒。
2.病毒检测：采集犬的粪便、呕吐物等样品，通过PCR、病毒分离等方法检测犬细小病毒。
二、治疗方法1.支持治疗：在早期病情轻微的情况下，可以通过给予犬充足的水分、营养和休息进行治疗。
适当的饮食管理和环境控制可以减轻犬的不适感。
2.抗病毒治疗：犬细小病毒病没有特效药物，但可以通过使用抗病毒药物来控制症状、缩短病程和降低死亡率。
常用的抗病毒药物包括奥司他韦、解磷胆碱等。
三、防控措施1.疫苗预防：注射犬细小病毒疫苗是预防犬细小病毒病最有效的措施。
疫苗分为MLV （弱毒活疫苗）和KV（灭毒疫苗），分别具有一定的优势和适应症。
首次注射疫苗后，需要进行加强免疫，以提高免疫效果。
2.环境控制：对于犬细小病毒病的患犬，需要将其隔离并消毒其周围环境，以阻断病毒传播。
对于病毒感染风险较高的场所，如犬舍、寄养所等，需要加强消毒工作。
3.注意个体卫生：及时清洁犬的食具、床上用品、口水、尿液等，避免直接接触患病犬。
诊断、治疗和防控犬细小病毒病是保护犬健康的重要措施。
病主人可以及时寻求兽医的诊断和治疗，保持犬个体卫生，并通过疫苗预防和环境控制来降低病毒感染的风险。
为了犬的健康，所有养犬人必须认真对待犬细小病毒病的预防与控制工作。
犬细小病毒病的诊断与治疗.doc
犬细小病毒病的诊断与治疗概述：一、诊断现场诊断可以根据流行病学、特征临诊症状和病理变化等做出初步判断。
实验室确诊需要进行如下检查。
(一)病毒分离与签定用患病犬粪便液或濒死期扑杀犬的肠内容物，加适量氯仿混匀，置4摄氏度过夜处理，离心后上清液接种MDCK、F81等传代细胞分离培养病毒。
也可采取濒死期病犬的肾、肺或睾丸作细胞培养，5—7天后转原代或继代细胞，也易获得病毒，可用荧光抗体染色、微量血凝抑制试验等对分离病毒进行鉴定。
(二)血清学诊断微量血凝试验和血凝抑制试验、灾光抗体技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法可用于该病的特异快速诊断。
国内外常用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验。
血凝试验用于测定粪便和细胞培养物中的病毒效价。
用0.5%—1%猪红细胞指示系统。
试验证明HA1：80可作为阳性感染的指示标准。
血凝抑制试验主要用作流行病学调查，也可用于检测粪便中的抗体。
在诊断中要注意与犬瘟热、犬传染性肝炎和出血性胃肠炎等疾病进行区别诊断。
二、治疗1.心肌炎往往来不及治疗就发生死亡，即使治疗，其效果往往不佳，常以死亡告终。
2.肠炎型治疗原则是特异性血清治疗，配合对症、抗菌、解毒、抗休克治疗和防止继发感染。
3.特异性血清治疗：使用抗犬细小病毒高免血清进行治疗，效果可靠。
4.对症治疗：注射阿托品止呕吐：腹泻可口服硝酸铋、鞣酸蛋白;出血性腹泻可注射维生素K、安络血等止血剂;出现脱水可补液，注意先盐后糖，采用静脉注射，如有困难可采用腹腔注射;结膜发绀则加入碳酸氢纳防止酸中毒。
5.防止继发感染：可使用庆大霉素、红霉素、卡那霉素等抗菌药物，也可配合使用抗病毒药物。
6.在护理上要注意病初应禁食1—2天;恢复期应控制饮食，给予稀软易消化的食物，少量多次，逐渐恢复到正常饮食。
犬细小病毒的分离鉴定_辛秀
表达[D]. 北京: 中国农业科学院, 2008. [ 9 ] 渠川玫, 徐在海, 彭传贵, 等. 犬细小病毒在乳猫肾细胞中的增
殖动态[J]. 中国畜禽传染病, 1994, 16（5）: 5-7. [10] Decaro N, Desario C, Elia G, et al. Occurrence of severe gastroen⁃
56 ℃ 水浴 30 min 灭活阴性和阳性血清，并将 病毒液稀释至 200 TCID50·100 μL-1 作为抗原，将灭 活的 CPV 阴性、阳性血清用 MEM 培养液 2 倍稀 释，加在 96 孔 U 型细胞培养板的孔中，加入等体 积的抗原，混匀后 37 ℃ 感作 1 h，接种长满单层
的 F81 细胞于 U 型细胞培养板，每个稀释度接种 4 孔，100 μL·孔-1，设抗原对照孔，逐日观察细胞 病变。 1.2.4 PCR 鉴定
200 [参考文献]
100
图 2 病毒分离 PCR 检测结果 1. DL 2 000；2.分离株
2.5 动物试验结果 用病毒分离株感染幼犬后第 5 天，试验组均发
病，表现为连续拉稀便、身体脱水、精神沉郁、 食欲废绝；对照组健康。在感染后第 10 天将病犬 扑杀剖检，发现空肠和回肠局部充血、脾肿大、 肠系膜淋巴结水肿，符合犬细小病毒病剖检特 征。说明该分离株有较强的致病性。 3讨论
收稿日期：2011-04-02 基金项目：吉林农业科技学院大学生科技创新项目（2010026） 作者简介：辛秀（1988—），女，吉林辽源人，研究方向为预防兽医学。 *通讯作者：副教授。
50 饲料博览 2012 年第 1 期
一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析
种优 势 ， 尽管不 如育肥性 能 明显 。商品 肉兔 半净膛 率和 全净膛率分别 为５ ． Ｉ ３４ ５６ ］ ． ％￣ ５ ％，后腿 比例 高达 ３ ． ９１ ％，显
示 出较 高 的产 肉 能 力 。 在 肉品 质 方 面 ，Ｉ 和 商 品 代 的 熟 Ｉ 系 肉率 高 于Ｉ ， 说 明 保 水 性好 ；剪 切力 值 较 小 ， 肉较 嫩 。 系
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５７ 。Ｉ Ｉ 交 商 品 兔 在 产 肉性 能 上 也 有 一 定 程 度 的 杂 ． ％ ＸＩ杂
装 的加 工。而皮 板品质指标的变异系数均在 ｌ％以下 ，说 Ｏ 明不 同皮张质量 的一致性较高 。
表３ 商品 兔皮 板质 量评 定结 果 （ｍ、分 ） ｃ
６
２１ 年第 １ （ ０１ 期 总第 １８ ） ６期
毒 ，定名为Ｂ Ｙ２ ０ 。对其ＶＰ 基因进行 了扩增测序 ，初 Ｊ ０６ ２
步 确 定 为２ 亚 型 。 对 该 病 毒 的遗 传 特 性 与 演 化 进 行 了研 ａ
显 的细 胞病 变 ，病 变发 生 在接 种后 ５ｈ，表现 为细 胞 圆 ０
山
３ ２
一
株 犬细 小病毒 的分离及Ｖ ２ 因序 列分析 Ｐ基
杨龙峰① 李英 杰① 艾萍萍① 肖胜 南① 韩 柳② 焦万亮① 王建芬① 张延光① 刘月焕
（ 北京 市延 庆县 农业局 １２０ ② 北 京诚安 动物 医院 ① ０ １０
摘要
⑧ 北京 市农 林科 学 院畜牧 兽 医研 究所 ）
中图分类号 ：￥ ５ ． ８ ２ ５５ ６
１７ 年 ，犬 细小 病毒（ａ ｉｅ ｐｒｏ ｉ ｓ Ｐ 同 时从 ９８ ｃｎｎ ａｖ ｖｒ ， ｖ） ｕｃ 加拿大（ ｈｍｓｎ 、澳 大利亚（ ｌ ） Ｔ ｏ ｏ 等） Ｋｅｙ 患肠炎 的病犬 中分 ｌ 离获得【。Ｃ Ｖ可 引起 犬的出血性肠 胃炎和心肌 炎，并使 ‘ Ｐ 】 白细胞 大量减 少 ，在 幼犬 中的发病 率和死 亡率 都很高 ， 症 状 与猫 泛 白细 胞 减少 症 相似 。本 病 虽 出现 的时 间不
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犬细小病毒的分离与鉴定摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。
结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。
关键词：犬细小病毒；分离；鉴定犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。
CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。
CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。
CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。
病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。
根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。
本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。
1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。
1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。
1.2 方法1.2.1 试剂的配制1）1%猪红细胞悬液的制备。
用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。
使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。
2）HA抗原配制。
用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。
判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点沉于孔底时，凝集终点的稀释倍数即为该抗原的HA效价，将此效价除以8，即是8单位血凝抗原的稀释倍数。
1.2.2 病料的处理1）粪便样品的处理：将病犬粪便用DMEM培养液稀释（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清，加入双抗200 μL，4 ℃过夜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。
2）脏器样品的处理。
将脏器样品用灭菌后的研磨器进行研磨，并反复冻融3次，同时加入9倍体积的DMEM细胞培养液，5 000 r/min离心25 min，取上清液，经过滤除菌。
将处理好的样品置-20 ℃保存，待分离鉴定。
1.2.3 血清样品HI抗体效价的测定取待检血清0.2 mL，加入猪红细胞悬液1滴，混匀于室温吸收1 h，离心取上清液待检。
先用移液器向血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取待检血清25 μL，在血凝板上倍比稀释，最后2孔不稀释作为对照，每孔加8单位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作为血清对照。
加完后振荡混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h判定。
判定的方法是以完全不凝集为终点，在抗原对照孔完全凝集，血清对照孔完全不凝集的情况下，血清出现终点抑制的稀释倍数，即为该血清的HI效价。
1.2.4 病毒的分离采用同步接毒法，在F81细胞消化传代后，按培养液量体积的1/10接入处理过的样品，37 ℃静置培养3～5 d，每天观察有无细胞病变。
如无细胞病变，则于培养的第4～5 d收取上清，继续按常规传代培养，至第5代仍无病变判为分离结果阴性；若出现细胞病变则分离结果为阳性，反复冻融3次，收毒，-20 ℃保存。
1.2.5 生物学特性鉴定1）理化特性。
按《动物病毒学》[3]规定进行，取分离病毒的F81细胞培养物，分别做以下处理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振荡10 min，放4 ℃过夜，并无菌挥发除去全部乙醚；将病毒液调节pH为3时于4 ℃作用处理1 h，再用0.1 mol/L NaOH调至pH 7.2，进行耐酸性试验，然后分别用F81细胞测定其TCID50变化。
2）红细胞血凝试验。
采用微量血凝（HA）试验，分别用0.5%的鸡、猪、大鼠、兔和人（O型）的红细胞悬液测定病毒培养液的HA效价。
3）细胞敏感谱。
选用猫肾传代细胞系（F81）、犬肾传代细胞系（MDCK）作为接种对象，分别分离得到HA效价≥1∶128的细胞培养液。
按常规方法进行同步接毒，37 ℃静置培养24 h后，换液，每天观察细胞病变（CPE），4～5 d 收获冻融，再以同样方法连传5代，以出现CPE作为感染指标。
1.2.6 动物回归试验用所分离的CPV分离株1，2和3（HA效价均为1∶512～1∶2 048）对试验犬进行人工感染试验。
接种途径为口服，剂量为5 mL，设空白对照组和试验组。
将幼犬随机分为4组，每组2只。
试验Ⅰ组幼犬接种分离株1；试验Ⅱ组幼犬接种分离株2；试验Ⅲ组幼犬接种分离株3；将第4组设为空白对照，接种生理盐水。
对4组试验犬进行隔离饲养。
接种后，每天观察试验犬的临床变化并进行体温的测量，每3 d进行一次白细胞计数，自接种后5 d开始收集粪便，并进行CPV的HA/HI检测。
攻毒后观察15 d，如无眼观临床症状、白细胞总数正常，则视为试验犬健康。
2 结果与分析2.1 病毒分离结果将处理后的病料接种F81细胞后，采用同步接毒进行病毒分离。
在第一代细胞病变不明显，但盲传至第3～5代时，部分接毒细胞出现细胞圆缩、拉网和脱落等细胞病变，而对照细胞排列紧密，生长旺盛，呈不规则形（见图1～2）。
试验共从3份病料中分离出病毒，分别命名为CPV分离株1、分离株2和分离株3。
2.2 生物学特性1）理化特性。
经50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）处理后，通过比较处理前后TCID50的变化发现TCID50效价相差都小于2个数量级，变化不大。
说明分离毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和热（50 ℃），这与细小病毒理化特性一致。
2）红细胞血凝结果。
采用微量血凝试验测定各病毒分离株对鸡、猪、大鼠、兔和人红细胞的HA效价。
分离株对猪红细胞的凝集效价达到1∶27～1∶210；而对其他红细胞的血凝效价为20，没有血凝性。
与文献记载的CPV血凝谱相符。
3）细胞感染谱。
将CPV分离株在多种细胞上同步接毒培养5代，并每天观察CPE。
结果表明，有3株CPV分离株连续传代后出现细胞病变现象，分别命名为分离株1、2、3。
2.3 动物回归试验结果用病毒分离株感染幼犬后第5～6天，试验组均发病。
其中试验Ⅲ组即接种CPV分离株3的2只幼犬在接种后第5天开始出现临床症状，精神沉郁，呕吐，排稀粪。
随后转为拉血、脱水、食欲废绝，最后死亡。
对病死幼犬病理剖检发现空肠和回肠局部充血、粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀，肠腔内有血样粪便。
其他2组试验组犬接种后第6天表现出精神沉郁，体温增高，食欲下降，拉稀便，但后来自行康复。
所有接毒试验犬的白细胞总数均出现不同程度的下降。
但对照犬的白细胞总数没有明显变化。
试验组犬在攻毒后5～8 d，幼犬粪便的HA效价为1∶128～1∶512，对照犬的粪便HA检测结果均为阴性。
3 讨论3.1 病毒分离本试验通过采集疑似CPV感染犬的粪便和内脏，经处理后接种于猫肾细胞分离病毒，然后通过对分离病毒的生物学特性、血凝抑制试验和动物回归试验等方法对病毒株进行了鉴定。
CPV无囊膜，用氯仿处理粪便可使有囊膜的病毒失活，有利于该病毒的分离和纯化。
部分出血很明显的细小病毒样本，反而没有分离出病毒。
可能因为在疾病中后期，由于肠道出血，血液中的犬细小病毒抗体和细小病毒形成抗原抗体复合物，造成样品中的病毒量减少，细胞分离呈阴性。
粪便中毒素和组织分解代谢产物会对培养细胞产生一定的影响。
因此，如何处理粪便，尽量减少对细胞的毒性，成为能否成功分离病毒的关键。
可以减少接种样本数量（1/20～1/30），或接种后及时换液，可有效降低粪便中毒素对细胞的毒害作用，提高病毒分离率。
CPV的复制须完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，复制主要发生在细胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接种最好采用同步接种方式。
所以，在试验中采用了同步接毒的办法。
但由于样本的毒性，可以在传代后6～8 h再接种，能减少样本对细胞的影响。
3.2 病毒鉴定通过对分离的病毒进行理化鉴定，发现所分离的病毒具有抗酸、抗脂溶剂和耐热的特性，与文献报道的细小病毒的理化性质一致。
通过对不同动物红细胞的血凝谱测定，所分离病毒能够凝集猪的红细胞，不能凝集鸡、兔和人的红细胞，与报道的CPV的血凝谱一致。
病毒除了能在F81细胞增殖外，病毒株2还可以在MDCK细胞增殖。
病毒血凝抑制试验进一步确认所分离的病毒血凝特性能够被犬特异性细小病毒血清抑制，证明试验中分离到的病毒为犬细小病毒。
3.3 动物回归试验为了检验所分离犬细小病毒的致病性，进行了动物回归试验，分别将3株病毒人工接种试验犬。
动物试验结果显示，试验组均发病，表现为拉稀、脱水、精神沉郁、食欲废绝，对照组健康。
本试验采用F81细胞同步接毒的方式从送检的疑似CPV感染的30份样品中分离出3份CPV阳性样品。
并对分离病毒进行了生物学和动物接种试验，检验了分离病毒的致病性。
其中分离株3可以引起接种幼犬死亡，表明是一株犬细小病毒的强毒株。
本研究为犬细小病毒病的预防和控制提供了理论依据，同时为深入研究该病毒的致病机理奠定了基础。
参考文献：[1] 马景霞.犬细小病毒研究进展[J].山东畜牧兽医，2008，29（5）：47-49.[2] 赵世华，宋爱军，陈伟，等.犬细小病毒（CPV）内蒙古分离株的体外培养特性研究[J].畜牧与饲料科学，2010，31（9）：168-169.[3] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].第二版.北京：科学出版社，1997.[4] 王淑君，杨松涛，陈创夫，等.犬细小病毒四川流行株分离鉴定及其遗传进化分析[J].现代生物医学进展，2009，9（10）：1888-1890.[5] 刘志强，张小莺，黄新，等.新疆石河子地区犬细小病毒的分离鉴定与基因型分析[J].中国兽医杂志，2010，46（8）：44-46.[6] 蔡宝祥.家畜传染病学[M].第5版.北京：中国农业出版社，2006：422-425.[7] 戈锐，彭广能，夏咸柱，等.犬细小病毒四川株的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2007，29（11）：836-839.[8] 杨龙峰，李英杰，艾萍萍，等.一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析[J].山东畜牧兽医，2011，32（1）：6-8.[9] 易立.犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达[D].北京：中国农业科学院，2008.[10] 杜强，邱薇，范泉水，等.犬细小病毒的分离鉴定[J].动物医学进展，2009，30（3）：55-58.[11] 宋桂强，龙贵伟，范泉水，等.犬细小病毒病的研究进展[J].中国畜牧兽医，2007，34（3）：98-100.[12] 张仁舟，杨松涛，冯昊，等.中国国内首次检测到犬细小病毒CPV2c[J].中国病原生物学杂志，2010，5（4）：246-249.[13] 魏巍，李肖梁，帅江冰，等.犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定[J].畜牧与兽医，2008，40（7）：1-4.。