激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜
1、 选择好适宜的荧光探针。 原则上讲,无论是荧光素还是荧光标记抗体均 可用于LSCM 。如果打算用2种以上荧光标记物,要 注意它们是否激发光波长及发射光波长能区别开， 还要注意是否与LSCM的激发器相匹配，要根据现有 的激发波长来选择荧光标记物。
• 不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，故除综合 考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找 出最适的荧光探针。
6.观察活细胞、活组织：ＬＳＣＭ在不损伤
细胞的前提下，对活组织、活细胞进行观 察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期 处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观 察过的样品还可以继续用于其他的研究。 这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为 重要。这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
7. 生化成分精确定位观察配合专用的分子探 针，对于要检测的成分不仅可以定位到细 胞水平，还可以定位到亚细胞水平和分子 水平。
2015/6/12
激光扫描共聚焦显微镜：以激光作为激发光源，采用 光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫 描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统.
形态学研究：组织细胞 标本的抗原免疫荧光检 测，凋亡检测…
目的结构是用荧光探针标记的， 都可以用激光共聚焦显微镜观察
分子生物学：荧光原位杂交对DNA 和RNA定量，外源基因在真核细胞 的表达及定位，蛋白质相互作用 (FRET)…
4. 采 用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光 束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的 光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的 衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无 法相比的。
5.光电倍增管：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成 电 信号，相当于相机中的CCD或胶卷。 PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录 的 结果通过信号强度和填充颜色表示。PMT单位用电压值V 表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图 像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
激光扫描共聚焦荧光显微镜名词解释
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激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscope，简称CLSM）是一种高级光学显微镜，利用激光光源和共聚焦技术，能够实现高分辨率的三维荧光成像。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理介绍激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LS-CFM）是一种先进的显微镜技术，用于获取高分辨率的细胞和组织图像。
它基于激光光源和共聚焦原理，通过激发标记的荧光物质来提高显微镜的分辨率和对比度。
本文将详细介绍LS-CFM的原理和应用。
激光扫描共聚焦显微镜的工作原理激光光源LS-CFM使用激光光源作为激发荧光物质的光源。
激光光源具有高强度、单色性和方向性，可以提高显微镜的灵敏度和分辨率。
扫描系统LS-CFM的扫描系统包括镜片、扫描镜和探测器。
激光光束经过镜片聚焦到样本上，扫描镜通过改变反射角度来扫描样本表面，探测器记录荧光信号。
共聚焦原理共聚焦原理是LS-CFM的核心原理，它通过控制扫描镜的运动和探测器的观察位置，只获取样本特定平面（焦平面）的荧光信号。
由于样品处于共焦面上时探测荧光的最大值，可以得到高分辨率图像。
荧光物质激发和发射过程在LS-CFM中，荧光物质被激光光源激发后会发射荧光。
荧光物质的发射波长通常比激发波长长。
激发光和发射光通过不同的光路，以避免激发光干扰荧光信号。
LS-CFM的优势1.高分辨率：共聚焦原理使LS-CFM能够获取超过传统荧光显微镜的分辨率，可以观察更细微的结构和细胞器。
2.高对比度：由于共焦面上只有样品发出的荧光被探测到，背景信号减少，对比度更高。
3.深度扫描能力：LS-CFM具有深度扫描能力，可以获取样本的三维图像。
这对于观察细胞内部结构和复杂的生物组织是非常重要的。
4.实时观察：LS-CFM可以实时地观察样本，能够捕捉到细胞和组织的动态变化。
5.多光标标记：通过使用不同的荧光标记剂，LS-CFM可以同时观察多个分子或细胞器的位置和相互作用。
LS-CFM的应用生物医学研究LS-CFM在生物医学研究中扮演着重要的角色。
它可以用于观测细胞分裂、细胞迁移、细胞凋亡以及细胞器的分布和运动。
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光扫描共聚焦显微镜（LaserScanningConfocalMicroscopy
激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM)成像技术目的结构是用荧光探针标记的，都可以用激光共聚焦显微镜观察形态学研究：组织细胞标本的抗原免疫荧光检测，凋亡检测…分子生物学：荧光原位杂交对DNA和RNA定量，外源基因在真核细胞的表达及定位，蛋白质相互作用(FRET)…活细胞动态荧光测量：细胞内Ca2+、Cl-等离子的动态分布及定量，细胞连接间的信息传递(FRAP)…成像基础：荧光成像主要原理：利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测。
z sections = imagesyzx激光共聚焦显微镜的设计特点：Laser：经过照明针孔后形成点光源，光源方向性强、发散小、亮度高、颜色纯、单色性强Beamsplitter(光束分离器)：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。
Pinhole (照明针孔和探测针孔)：最大限度的阻挡非聚焦平面以及聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品焦点位置PMT (PhotoMultiplier Tube, 光电倍增管)：检测设定范围内的光信号，并将光信号转换成电信号，相当于相机中的CCD或胶卷PMT只能检测到信号的强弱，不能记录信号的颜色，记录的结果通过信号强度和填充颜色表示PMT单位用电压值V表示，数值越大代表信号倍增越大，提高倍增会同时增加图像的正常信号强度和噪声信号强度，使图像的信噪比下降激光扫描共聚焦与传统荧光显微镜的主要区别： 激光扫描共聚焦显微镜只接收共焦点处荧光。
普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收。
影响来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率（焦平面以外的荧光结构模糊、发虚）。
CCDPMTFV1000 (Olympus)：多个荧光通道(405, 458, 488, 515, 543, 633)，可同时检测多个荧光标记一个透射光通道，透射光图像为非共焦图像激光扫描共聚焦显微镜的主要应用No.1 免疫荧光染色(单标、双标、多标)细胞浆、核、膜抗原的分布、半定量分析 几种抗原的共定位抗原与细胞器的共定位抗原转位No. 2 荧光标记活细胞内成分：氯离子荧光探针：MQAE[N -(Ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide]细胞内pH的荧光探针：BCECF AM[2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester]活性氧荧光探针：DCFH-DANO荧光探针：DAF-FM DA[3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein, diacetateNo. 3 荧光标记各种亚细胞结构：细胞内微丝：荧光染料标记的毒蕈肽(phalloidin)细胞膜荧光探针：DiI 即DiIC18(3) [1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，红]和DiO即DiOC18(3) [dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，绿] 内质网探针：荧光标记的glibenclamide高尔基体探针：荧光标记的C5-ceramide。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理激光扫描共聚焦荧光显微镜原理一、概述激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）是一种高分辨率、高灵敏度的生物成像技术，它通过激光和荧光探针相互作用，实现对生物样品的高清晰成像。
本文将详细介绍LSCM的原理。
二、激发荧光信号的原理LSCM是基于荧光成像技术的，因此了解荧光信号的产生机制非常重要。
在LSCM中，通常使用的探针为有机染料或蛋白质标记物。
这些探针受到激发波长（通常为紫外线或蓝色激光）后会被“激发”到一个高能态，并在短时间内返回基态时释放出能量，即产生荧光信号。
三、扫描共聚焦显微镜系统结构1. 激光器：LSCM中通常使用的激光器为氩离子激光器和氦氖激光器。
它们可以提供不同波长的激发波长，以满足不同探针的需求。
2. 光学系统：光学系统包括激光束聚焦、激光扫描和探测系统。
其中，激光束聚焦是将激光束聚焦到样品上的过程，通常使用的是物镜；激光扫描是将激光束在样品表面移动的过程，通常使用的是振镜；探测系统用于收集荧光信号，并将其转化为数字信号。
3. 样品台和样品固定装置：样品台用于放置样品，通常可以进行XYZ三向移动。
样品固定装置可以确保样品不会在成像过程中移动或震动。
4. 计算机：计算机用于控制整个系统，并处理、分析和显示成像数据。
四、扫描共聚焦显微镜成像原理1. 感应体积：感应体积是指在LSCM中能够产生荧光信号的三维区域。
它由两个因素决定：一个是物镜的数值孔径（NA），另一个是激发波长。
感应体积越小，则分辨率越高。
2. 扫描方式：LSCM采用的是点扫描或线扫描方式。
点扫描方式是将激光束聚焦到样品上的一个点，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕；线扫描方式是将激光束聚焦成一条线，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕。
3. 探测方式：LSCM采用的是共聚焦探测方式。
共聚焦探测可以减少背景信号和散射信号的干扰，提高成像信噪比。
五、LSCM应用LSCM广泛应用于生物学研究中，如细胞生物学、神经科学、分子生物学等领域。
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激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
2．1观察活细胞、活组织ＬＳＣＭ在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量，这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。
这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。
这可以说是ＬＳＣＭ最大的优势。
2．2 生化成分精确定位观察配合专用的分子探针,对于要检测的成分不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平2．3 动态观察在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。
目前在这方面做得最多的是使用ＬＳＣＭ观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或ｐＨ的动态变化。
2．4 数据、图像的数字化用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。
2．5 定量测量首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。
3 华中地区有激光共聚焦显微镜机构的品牌和技术参数3．1中国科学院武汉病毒研究所，3．2湖南中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所LSCM(BIO-ROD1024,HOMEL HEMPSTEAD,UK发表过应用激光扫描共聚焦显微镜观察骨组织为损伤的实验研究3．3华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科激光扫描共聚焦显微镜(ＭＲＣ 1024型),美国ＢｉｏＲａｄ公司生产发表过激光扫描共聚焦显微镜检测核因子κＢ4激光扫描共聚焦显微镜的使用（cAMP在体测量为例）4．1样品制备4．1．1切片 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。
所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。
常用的贴附剂有：多聚赖氨酸，伴刀豆球蛋白，蛋清，琼脂明胶cell-Tak, vectabond等。
4．1．2培养细胞 培养细胞可以满足要求，如果用购置仪器时所带的薄底培养瓶进行培养则更佳4．1．3激光共聚焦观察样品处理注意事项首先要尽量保持生物材料的天然状态，避免赝像、变形和失真，因此须将生物材料做固定处理；制片必须薄而透明，才能在显微镜下成像，除将材料切成薄片或通过轻压或其他手段使之分散外，还需采用其他方法使它透明和染色，以便更好地观察到结构的细节。
需长期保存的制片，还应进行脱水和封固。
显微制片法一般包括切片法、整体封片法、涂片法和压片法4类。
4．2荧光探针的选择荧光探针的发展非常迅速，目前仅美国Molecular Probes公司就可提供1800多种荧光探针[3，每年该公司还不断推出新的荧光探针。
通常每项检测内容或被测物质都有几种或几十种有关的或特异的荧光探针。
选择合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实验结果的保障。
荧光探针的选择主要从以下几个方面考虑：(1)现有仪器所采用的激光器。
如我校购进的激光扫描共聚焦显微镜(ACAS ULTMA312，美国Meridian公司产品)采用氩离子激光器，激发波长为351～364nm，488nm，514nm，可激发多种荧光探针；(2)荧光探针的光稳定性和光漂白性。
在进行荧光定量和动态荧光监测时，要求荧光探针有较好的光稳定性越高越好，也可通过减少激光扫描次数或降低激光强度的方法，来减轻光漂白的程度。
但在进行膜流动性或细胞间通讯检测时则需要荧光探针既有一定的光稳定性又要有一定的光漂白性；(3)荧光的定性或定量。
仅做荧光定性或仅是观察荧光动态变化时，选择单波长激发探针，无需制作工作曲线。
做定量测量时最好选用双波长激发比率探针，利于制定工作曲线；(4)荧光探针的特异性和毒性。
尽量选用毒性小、特异性高的探针；(5)荧光探针适用的pH。
大多数情况下细胞的pH在生理条件下，但当pH不在此范围时，考虑适用该环境pH的荧光探针是有必要的。
同时应注意染液自身的pH值会影响带电荷的荧光探针与胞内组份之间的结合，因此在染液的配备时需加以考虑。
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差异，除综合考虑以上因素以外，有条件者应进行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
此外，许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞，需使用其乙酰羟甲基酯(acetoxymethyl,AM)形式，也就是荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可与细胞内的靶结构或靶分子结合且不易透出质膜，从而能有效的发挥作用。
4．2．1细胞内游离钙美国分子公司提供的钙荧光探针有20多种，激光扫描共聚焦显微镜常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前两者为单波长激光探针，利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化，为钙定性探针；后两者为双波长激发探针，利用其双波长激发特点和比率技术，能定量细胞内［Ca2+］i，为钙定量探针4．2．2 DNA和RNA核酸的荧光探针有50多种［2］，用于激光扫描共聚焦显微镜的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。
4．2．3 膜电位DiBAC4(3)为最常用的膜电位荧光探针［5］，DiBAC4(3)为带负电荷的阴离子慢反应染料。
该探针本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，测量时要求细胞浸在荧光染料中。
当细胞内荧光强度增加即膜电位增加示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低示细胞超极化。
Rhodamine 123主要用于线粒体膜电位测量［6］。
Rhodamine123是一种亲脂性阳离子荧光探针，当线粒体膜内侧负电荷增多时，荧光强度增加，与DiBAC4(3)的表示形式相反。
4．2．4 pH值常用于偏中性pH即细胞胞浆pH检测的荧光探针有SNARF类(SNARF-1SNARF-calcein)、SNAFL类(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，这些探针均为疏水性探针，需使用其AM形式。
FITC-dextran则适用于pH范围4～6之间［7］，如溶酶体pH的检测，该探针也不能透过质膜，但可通过细胞胞饮作用进入溶酶体，因此应选择分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。
4．2．5 细胞内活性氧基活性氧(active oxygen species)可影响细胞代谢，与蛋白质、核酸、脂类等发生反应，有些反应是有害的，因此测量活性氧在毒理学研究中有一定的意义。
根据检测活性氧的不同可选择不同的荧光探针。
常用荧光探针有Dichlorodihydrof-luorescein diacetate(2，7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸、H2DCFDA)［2］，其原理是不发荧光的H2DCFDA进入细胞后能被存在的过氧化物、氢过氧化物等氧化分解为dichlorofluorescein(DCF)而产生荧光，其反应灵敏到10-12mole水平，荧光强度与活性氧的浓度呈线性关系。
4．2．6 细胞间通讯激光扫描共聚焦显微镜可采用荧光光漂白恢复FRAP技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力。
而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。
由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。
采用FRAP技术检测细胞间通讯常用荧光探针是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基荧光乙酰乙酸、CFDA)。
需用其酯化形式CFDA-AM。
该技术可用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用。
由于某些毒性物质尤是促癌物可影响缝隙连接介导的物质运输，因此该方法也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。
4．2．7细胞膜流动性采用荧光光漂白恢复(FRAP)技术还可对细胞膜流动性进行研究［9］。
利用NBD-C6-HPC 荧光探针标记细胞膜磷脂，然后用高强度的激光束照射活细胞膜表面的某一区域(1～2µm)，使该区域的荧光淬灭或漂白，再用较弱的激光束照射该区域。
可检测到细胞膜上其它地方未被漂白的荧光探针流动到漂白区域时的荧光重新分布情况。
荧光恢复的速率和程度可提供有关的信息，如用于观察细胞受体介导内吞过程中膜磷脂流动性的变化情况。
NBD-C6-HPC在温度稍高时可能会进入细胞内，因此荧光染色和测量时应在低于常温的环境下进行。
4．2．8细胞结构、受体、蛋白质、酶等激光扫描共聚焦显微镜可获得较一般普通光学显微镜分辨率高的细胞内线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体等细胞器图象，同时还可动态观察活细胞状态下细胞器的形态学变化情况，此外还可通过光学切片即断层扫描技术进行三维重建，显示细胞器的空间关系及其变化。