实验一蛋白质含量测定
实验一 动物细胞蛋白质的提取和含量测定
实验一动物细胞蛋白质的提取和含量测定实验目的：学习动物细胞蛋白质的提取方法，并利用比色法测定蛋白质含量。
实验原理：蛋白质是生物体中丰富的一类生物大分子，广泛分布于细胞内和细胞外，并参与生物体内多种生命过程。
动物细胞蛋白质的提取是分离蛋白质与其他细胞成分的过程，主要包括以下步骤：细胞破碎、离心、过滤、沉淀、溶解等。
比色法是常用的蛋白质含量测定方法，其基本原理为：在一定条件下，吸收光谱的特定波长处与蛋白质浓度成正比关系，当分子光吸收强度与物质的摩尔吸光系数（ε）和浓度（c）成比例时，吸收光强度与摩尔浓度成正比。
实验材料：鼠肝组织（或其他动物细胞）、PBS缓冲液、离心管、低速离心机、高速离心机、比色皿、分光光度计、升酸钠（NaOH）、双氧水（H2O2）、标准蛋白溶液。
实验步骤：1.将肝组织切碎并加入PBS缓冲液中，用器皿以适量缓慢但均匀的方式搅拌，使细胞尽可能充分破碎，制成15%（w/v）的组织均浆。
2.将组织均浆经低速离心（1000×g，5分钟）离心去除大的组织碎片和细胞核，得到上清液。
3.取出上清液，经高速离心（12000×g，10分钟）离心，得到上清液中的细胞蛋白质沉淀。
将上清液去除，并将沉淀用PBS缓冲液洗涤2-3次。
4.将蛋白样品溶解在PBS溶液中，并将其含量测量。
用比色法测量蛋白质的含量。
5.将一定量的标准蛋白质溶液（如蛋白质量为0.5mg/ml）放入比色皿中，取等体积的PBS作为对照。
将吸收光谱测试于580nm光波下。
6.将需要测定的试样溶液（不稀释或稀释到正常范围内）的吸光度值与标准曲线进行比较，并评估试样的蛋白质含量。
实验注意事项：1.组织均浆可以通过超声波等方式进行更好的细胞破碎。
2.在高速离心前，一定要充分清除离心管内假底残留的上清液及杂物。
3.比色法中，在标准曲线制备过程中，须注意所有物品洁净，不受污染。
标准品配制同样须严格控制。
实验结果：在蛋白质提取和测定后，实验者可计算并评估其蛋白质含量。
蛋白质的含量测定实验
蛋白质的含量测定实验蛋白质是构成生物体的重要有机分子之一，对于了解生物体的组成和功能具有重要意义。
在科学研究和食品加工等领域，准确测定蛋白质的含量是十分关键的。
本实验将介绍一种常用的蛋白质含量测定方法——低里氏法。
一、材料与试剂准备1. 组织样本：可以选择动植物组织，如肝脏、肌肉等。
2. 水浴锅：用于加热试剂，保持温度恒定。
3. 显色试剂：选择低里氏试剂，常见的有Bradford显色试剂。
4. 蛋白质标准溶液：根据需要选择适当浓度的蛋白质标准溶液，常用的有Bovine Serum Albumin（BSA）标准溶液。
5. 常用实验器材：包括离心管、移液管、离心机、比色皿等。
二、实验步骤1. 样本制备：a. 提取组织样本：取适量的组织样本，如肝脏、肌肉等，使用离心机将其离心，去除杂质和溶液。
b. 重建组织样本：向组织样本中加入一定体积的溶液，使样本浓度适宜，便于后续的测定。
2. 样本处理：a. 取相同体积的样本和蛋白质标准溶液，分别加入离心管中。
b. 添加适量的显色试剂，轻轻摇匀，使样本和标准溶液均匀与显色试剂充分接触。
c. 将离心管放入水浴锅中，调节温度为适宜条件，如常温或37℃。
d. 静置一段时间，使显色反应充分进行。
3. 比色测定：a. 取适量的显色反应液，加入比色皿中。
b. 使用光密度计或分光光度计，以试剂空白对照为基准，测定各个样本的吸光度。
c. 根据吸光度的读数，结合标准曲线，计算出样本中蛋白质的含量。
三、数据分析与结果解读根据实验的结果，我们可以得到样本中蛋白质的含量。
通过对不同样本的测定，可以比较不同组织或不同处理条件下蛋白质含量的差异。
同时，通过与蛋白质标准溶液的比较，可以验证测定方法的准确性和可靠性。
实验结果的解读应根据具体情况进行。
如果是在科学研究中，可以将结果与已有文献进行比较，探讨其在生物体功能或代谢方面的意义。
如果是在食品加工中，可以根据蛋白质含量的测定结果来评估食品的营养价值和质量。
蛋白质含量测定实验报告
蛋白质含量测定实验报告
实验目的：测定样品中蛋白质的含量。
实验原理：
蛋白质是生物体中重要的营养成分，其含量的测定对于食品、生物化学研究等都具有重要意义。
本实验采用双氧水法测定蛋白质的含量。
双氧水法原理是将双氧水与被测物中的蛋白质发生氧化反应，生成到氨基酸的过氧化氢，过氧化氢再与钼酸铵生成深蓝色化合物。
根据形成的深蓝色化合物的吸光度与蛋白质的含量成正比关系，可以通过比色法测定样品中蛋白质的含量。
实验步骤：
1. 将待测样品和标准蛋白质溶液分别取1ml到不同的试管中。
2. 加入4ml双氧水试剂，混匀。
3. 在室温下放置20分钟。
4. 加入适量的硫酸试剂，混匀。
5. 在60℃水浴锅中恒温加热10分钟。
6. 冷却至室温。
7. 分别将标准蛋白质溶液和待测样品溶液吸取1ml到比色皿中。
8. 用比色皿中的溶液分别测定吸光度，以比色皿中双氧水试剂为参比。
9. 根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验结果：
根据吸光度测定值和标准曲线得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
实验讨论：
蛋白质的含量测定是一项常见的实验，通过双氧水法可以快速准确地测定样品中蛋白质的含量。
在实验过程中，应注意操作的准确性和实验条件的控制，避免测定误差的产生。
此外，标准曲线的制备和测定结果的分析也是关键步骤，应进行仔细的处理和验证。
实验结论：
经过测定，得到待测样品中蛋白质的含量为X mg/ml。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
实验一 考马斯蛋白质含量测定
实验一考马斯亮蓝蛋白质含量测定一、实验目的1、验证对于微量移液器操作技术的掌握技术；2、结合实验结果，找出不足之处，通过实践训练以达到微量移液器操作规程的要求。
二、实验原理利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
三、实验方法方案一：酶标仪测定实验材料：96孔板，移液器及吸头，考马斯亮蓝G250染色液，稀释液，蛋白质标准溶液，酶标仪实验方法：1、按顺序在96孔板内加入相应体积的稀释液、蛋白质标准溶液或样品溶液。
考马斯亮蓝蛋白质含量测定2、各孔加入200µlG250染色液，室温反应3分钟。
3、设定1号管为空白孔，用酶标仪测定各孔OD59值并打印测定结果。
方案二：分光光度计测定实验材料：移液器及吸头，考马斯亮蓝G250染色液，稀释液，蛋白质标准溶液，试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计实验方法：一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液1. 标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1 mg/mL蛋白溶液。
2. 待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15 mol/L NaCl稀释200倍。
三、器材试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。
生化实验 实验一：蛋白质含量测定方法的研究
实验一：蛋白质含量测定方法的研究一、研究背景：目前常用的蛋白质含量的定方法有四种：凯氏定氮，Folin-酚法，考马斯亮蓝法，紫外法。
几种方法各有各自的优势和精确度，根据不同的材料应选择不同的检测方法。
二、研究目标：通过对不同测定蛋白质含量方法的比较，找出实际实验操作中针对不同底物的最佳选择。
三、研究策略：对同样的蛋白质样品，用紫外法，Folin-酚法，考马斯亮蓝法四种方法进行测定，再向蛋白质样品中分别加入酪氨酸，EDTA ，嘌呤，再用三种方法进行测量，再将测量结果进行比较。
四、研究方案及可行性分析：经过上周的讨论以及老师的分析，我们必须绕过“标准浓度”这个判定方法，因此用增大杂质的影响的方法进行比较。
在生物样品中分别加入不同杂质，再进行测量，受某种杂质影响较大的实验方法测量出的结果必然会与另两个的结果有较大的偏差，因此可以比较出在不同非蛋白质杂质对不同测量方法的影响，因此可以作为日常实验中的选择依据。
五、具体实验设计1.试剂与仪器（1）试剂：标准牛血清蛋白溶液，1mg/ml；考马斯亮蓝G-250；乙醇；磷酸（85%）；试剂甲：10g碳酸钠，2g氢氧化钠，0.5g酒石酸钾钠溶解后用蒸馏水定容至500ml；0.5g五水硫酸铜溶解后，用蒸馏水定容至100ml；试剂乙：1NFolin--酚试剂(乙)；蛋白质样品：绿豆芽下胚轴；EDTA0.05g，饱和酪氨酸溶液1ml；嘌呤溶液1ml（2）仪器紫外分光光度计；移液管0.5*1,1ml*2,5ml*1；试管和试管架；722型分光光度计；恒温水浴；具塞刻度试管：15ml*8；小烧杯2个，漏斗及架；分析天平，容量瓶，研钵；离心机，药物天平；量筒10ml*1,刻度吸管：1ml*2,0.1ml*2，剪刀2.具体操作步骤与原始数据记录（1）紫外法测定蛋白质含量：按下表配制溶液→1cm石英比色杯测光密度值→绘制标准曲线→1g绿豆芽下胚轴研磨→50ml容量瓶定容，过滤，取滤液为样品A1→重复上步3次，在滤液中分别加入EDTA,酪氨酸溶液，嘌呤溶液，标记为乙试剂→半小时后650nm下比色→绘制标准曲线→按步骤(1)制取相同绿豆芽下胚轴滤→595nm下比色→绘制标准曲线→按步骤（1）制取样品，标号A3，B3，C3，六、质疑及相关思考对于测定蛋白质含量的实验，是否需要做几组平行实验？如果全部都做平行实验，则实验量过大，是测量程序变得复杂，参考书上的资料，也不是全部都有平行组。
实验一食品中蛋白质含量测定凯氏定氮法
营养技能实训指导≤烹饪营养与安全≥课程组福州黎明职业技术学院药学系2007年02月目录1、实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）2、实训二食物中脂肪含量的测定（索氏抽提法）3、实训三荧光法测定食物中维生素B24、实训四大学生食谱编制与计算5、实训五用配餐软件配制幼儿园一周食谱6、实训六烹饪营养配餐与菜单设计7、实训七厨房用具砧板的卫生调查（细菌菌落总数测定）8、实训八厨房卫生调查（大肠菌群快速检测法）实训一食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；0.0140 ——1.0mL 盐酸[c(HCl) 1.000mol / L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；m——样品的质量（g）；F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
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实验一蛋白质含量的测定
姓名：mangogola
一．实验原理
生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。
该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。
根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。
Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。
该方法灵敏度较高，但较费时。
对膜蛋白或相当稀的（如<1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。
原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。
此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。
需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h 内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。
二．实验过程（Lowry法）
1.溶液配制
A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。
（不能将NaOH和 Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确）
B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。
C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。
D液：Folin试剂
标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液
2.标准曲线测定
按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。
取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋
测得未知蛋白溶液的A500为0.076；0.070，平均值为0.073。
三．数据处理
A 500
软件拟合出的直线方程为：Y=7.17278E-4*X-6.73208E-4，R 2=0.99803，说明拟合效果比较好。
将未知蛋白溶液的A500平均值Y=0.073带入，计算得未知蛋白溶液的浓度为102.7 ug/ml 。
四．注意事项及分析
1.因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但实验中还原反应只在pH=10的情况下发生，所以将Folin 试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前发生还原反应。
2.添加蛋白溶液和试剂时尽量使用同一支移液枪，以减小误差。
3.测量吸光度时按蛋白浓度递增的顺序进行测定，这样可略去洗涤比色皿的步骤。
但测定未知蛋白溶液时要清洗并润洗比色皿。
4.预测本实验得出的结果是偏低的，由于所用比色皿较大，没有多余溶液用来润洗，所以造成了一定程度的稀释，造成结果偏低。