20170803 热激法转化质粒

20170803

热激法转化质粒

武汉大学Angelo

实验原理：

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。热激法：大肠杆菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，与转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子

实验步骤：

（1）从-80 ℃冰箱内取一管冻存的感受态大肠杆菌DH-5α于冰浴上融化复苏10min；

（2）加入待转化的质粒0.5μL-1.5μL，轻轻吹打混匀，冰浴30 min；

（3）在42 ℃恒温水浴锅中严格操作热激90 s，然后立即冰浴静置2 min；

（4）在无菌操作台内，向感受态大肠杆菌中加入600 μL-1000μLLB液体培养基，在200 r/min 、37 ℃恒温摇床内摇30min-1 h 进行活化；

（5）在活化的时候，从4℃拿出含抗生素的固体细菌培养板放到37℃恒温培养箱中回温十分钟。

（6）活化结束后，在无菌操作台内，吸取菌液20μL-40μL涂板到含抗生素（50 mg/ml）的固体细菌培养板上；

（7）置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养（12h-16h）。

要点：

1，固体培养板的抗生素抗性（Amp，Kana）

2，转化质粒的量根据质粒浓度进行添加

3，涂板菌液的量根据活化加培养基的量进行选择

4，注意每项工作前都要进行充分准备，比如涂板棒进行灭菌，移液枪进行消毒等。

5，对刚连接的质粒进行转化，不同之处在于活化时间为1-2h。

活化后，将菌液2500 -3500rpm离心3 min，留下沉淀和200 μL菌液，充分混匀，涂板到含抗生素的固体培养基上。