丙型肝炎检测讲解

丙型肝炎检测
目前丙型肝炎检测;
一、HCV抗体检测
二、HCV抗原检测 三、HCV核酸检测
四、HCV基因型检测
五、HCV细胞培养
丙型肝炎病毒抗体检测
一、抗-HCV检测的目的意义
1、抗-HCV检测可用于诊断、血液筛查、流行病监 测等。 2、以诊断为目的的检测是为了确定个体HCV感染 状况。 3、以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播 HCV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4、以流行病监测为目的的检测是为了解不同人群 HCV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、 重点人群和一般人群。
2、化学发光试验 化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高度敏度的化学 发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗 原、半抗原、抗体、激素酶、脂肪酸、维生素和药物等的 检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而 分为两种： （1） 化学发光标记免疫分析法：化学发光标记免疫分析 又称化学发光免疫分析（CLIA)，是用化学发光剂直接标记 抗原或抗体的免疫分析法。常用于标记的化学发光物质有 吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，通过起动发光试 剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速 的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反 应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法， 大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与 大分子的结合不会减少所产生的光量，从而增加灵敏度。
（二）HCV抗原检测的方法
目前抗原检测ELISA试剂采用双抗体夹心 法定性或定量检测样品中游离的HCV核心 抗原（包括抗原抗体复合物和游离核心抗 原）。基本原理：以基因工程核心抗原免 疫小鼠后所获得的纯化抗-HCV核心抗原单 克隆抗体作为固相包被物，用与固相包被 物有不同抗原决定簇的抗-HCV核心抗原单 克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物，与 样品中总的或游离的HCV核心抗原反应， OPD显色后进行定性或定量测定。
将HCV抗原的标准物质稀释成不同浓度 的系列标准，还可进行HCV抗原的定量检 测。以横坐标为HCV抗原的浓度 （pg/ml ），纵坐标为OD值，绘制出标准 曲线。测出待测样品的OD值以后，在标准 曲线上查出抗原的浓度。如果待测样品的 OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD 值，则需用阴性血清将样品稀释以后再行 检测。
（二）HCV核酸检测的方法
1、RT-PCR检测技术 传统PCR定性检测HCV RNA需要三个步 骤：①对待测样品进行处理：通过裂解、 纯化，提取样品中的HCV RNA作为PCR扩 增的模板；②采用逆 转录PCR（RT-PCR） 技术对提取到的HCV RNA进行扩增；③检 测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳 和PCR-酶联免反应（PCR-ELISA）等。
2、TMA检测技术
TMA是一种利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2 种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA的反应系统。 TMA使用的引物含有T7 RNA聚合酶 结合位点，使得反转 录合成的cDNA可以作为T7 RNA聚合酶的模板，在T7 RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷贝。扩增出来的 RNA重新进入TMA 循环，成为下一轮复制的模板。TMA 优点在于特异性强、灵敏度高，反应条件简单、扩增只需 一个温度，无需专门的热循环仪器，且因整个反应在一个 试管中进行，扩增产物RNA易于降解，从而大大减少了污 染的可能。 基于TMA技术的VERSANT HCV RNA定性检 测可检测到极低水平的HCV RNA，甚至可低至5IU/ml。
二、抗-HCV检测的方法
• 抗-HCV检测分为筛查试验（酶联免疫吸附 试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、 免疫荧光试验）和补充试验（免疫印迹试 验）。
（一）筛查试验
1、抗-HCV酶联免疫吸附试验 • 间接法酶联免疫吸附试验是抗-HCV检测常用的筛查方 法。其基本原理 是以HCV抗原包被固相载体，用辣根过氧 化物酶标记的抗人IgG与被检样品中的抗-HCV反应，以邻 苯二胺（OPD）或3，3‘，5，5’—四甲基联苯胺 （TMB） 等底物显色后，利用酶标仪等仪器进行阴阳性结果判断。 其主要 反应过程如下：加入经样本稀释液稀释的被检样品， 样品中的抗-HCV与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物； 固相载体上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及样品中的杂 质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；加酶 标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接 地标记上酶；洗涤后，固相载体上的酶量就显示特异性抗 体的量；加底物显色及终止液，利用酶标仪等仪器分析结 果。
（2） 化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学 发光酶免疫分析（CLEIA)应属酶免疫分析，只是反应的 底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶 标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫 反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信 号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。 该方法又分为如下几类： ① HRP （辣根过氧化物酶）标记的CLEIA：常用的底 物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺。是一类重要的发光 试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧 化物酶及活性氧（过氧化阴离子O2-，单线态氧O2，羟自 由基OH-，过氧化氢H2O2)存在下生成激发态中间体，当 其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直 接标记抗原或抗体，但标记后发光强度降低而使灵敏度 收到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应 后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光 试剂（NaOH2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依 赖于酶免疫反应物中酶的浓度。
② 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassayELEIA） 在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信 号， 并在较长时间内保持稳定， 便于重复 测量， 从而提高分析灵敏度和准确性。 ③ ALP（辣根过氧化物酶）标记的CLEIA 所用底物为环1，22二氧乙烷衍生物，用于 化学发光酶免分析底物而 设计的分子结构中 包含起稳定作用的基团—金刚烷基，其分子 中发光基团 为芳香基团和酶作用的基团，在 酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。
3、血液筛查相关的检测策略及结果报告
献血/浆员体检合格后抽血检验。用抗体筛查试 剂进行初筛，结果呈阳性反应，报告“抗-HCV阳 性待查”，献血/浆员暂停献血，如果需要进一步 诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；结 果呈阴性反应，报告“抗-HCV初筛阴性”，献血 /浆员献血，进入复检试验。 对初筛呈阴性反应的样品用另一种抗体筛查试 剂进行复检试验。如呈阴性反应，报告“抗-HCV 阴性”，血液供应临床；如呈阳性反应，则报告 “抗-HCV阳性待查”，血液报废，如果需要进一 步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略。
(2)补充试验
⑴临床诊断补充试验方法-1 复检试验阳性反应样品，进行免疫印迹试 验。结果阴性者，报告 “抗-HCV阴性”； 结果阳性者，报告“抗-HCV阳性”；结果 不确定者， 报告“抗-HCV不确定”，并进 行随访。临床诊断补充试验检测方法一流 程见图5。
⑵临床诊断补充试验方法-2
此方法仅限于检测方法/试剂给出了特定阈值 （与抗体补充试验比较，其阳性的预测值 ≥95%）时使用。高S/CO比值：当S/CO比 值≥特定的阈值时；低S/CO比值：其S/CO 比值<特定的阈值。 初筛和复检
3、实时荧光定量PCR技术
荧光定量PCR基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，当某个荧光 基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个 基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基 团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为 FRET。基于FRET原理，出现了不同种类的荧光PCR，主 要体现在探针设计的不同，如TaqMan探针、分子信标和荧 光杂交探针。以目前我国应用最广泛的TaqMan荧光标记探 针的定量PCR为例，是在探针（probe）的两端偶联一个短 波长的荧光基团（报告基团）和一个长波长的荧光淬灭基团， 这两个基团位置靠近，荧光基团不发荧光；Taq酶在发挥 5'→3'方向聚合酶活性的同时，还具有5'→3'方向的外切酶活 性，可使探针降解，荧光淬灭基团从而解离、远离荧光基团， 荧光基团发出荧光，荧光的强度与PCR产物的量相关，通 过计算可得出具体的量值。
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大部分HCV抗原检测试剂检测的是样品 中游离核心抗原以及和抗-HCV结合的核心 抗原，因此在进行检测之前需要加入尿素、 盐酸及去垢剂等，以解离样品中的核心抗原 -核心抗体免疫复合物。其它操作程序与一 般的ELISA或发光技术操作基本相同，即： 第一步加入待测样品，孵育后，洗 去未结 合的成分，加入酶标记或发光物质的抗核心 抗原的二抗，孵育后显 色，再加入终止液 终止显色，用酶标仪比色计算s/co值，来进 行阴性和阳性 反应的判断。
（三)检测策略及结果报告
初次检测抗原阴性样品，报告为“HCV 抗原阴性”；初次检测抗原阳 性反应样品， 需要双孔复检。如果双孔复检结果均为阴 性，报告为“HCV 抗原阴性”；如果双孔 检测结果至少有一孔结果为阳性反应，则 报告为 “HCV抗原阳性”。
丙型肝炎病毒核酸检测
（一）HCV核酸检测的目的意义 1、HCV RNA定性检测可用于血液筛查领域，可使 用单份样品或多样品集合的方法，对献血员血液 及单采血浆站的原料血浆进行核酸检测，降低输 血残余险度。 2、 HCV RNA定性检测可用于对HCV抗体阴性的高 危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期 感染。 3、HCV RNA定量检测的意义主要体现在作为抗病 毒治疗疗效的判断指标，指导抗病毒治疗及疗效 判定。
4. 检测结果的解释
丙型肝炎病毒抗原检测
㈠ HCV抗原检测的目的意义 1、HCV血清阳转前的早期急性丙型肝炎辅助诊断， 尤其有助于HCV感染窗口期患者、抗-HCV检测结 果不确定患者或HCV阳性母亲所生婴儿是否罹患 丙型肝炎的辅助诊断。 2、免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HIV感染者、 长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免 疫功能缺陷患者等HCV感染的筛查。 3、抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析。 4、HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。