石蜡切片与冰冻切片
石蜡切片VS冰冻切片
石蜡切片V S冰冻切片石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。
制作过程较石蜡切片快捷、简便，因而多应用于手术中的快速病理诊断。
实验步骤一、石蜡切片1.?固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
?4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5.包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片：一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9.染色：经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处
冰冻切片和【2 】白腊切片各自的好坏之处是什么1、从一抗的选择方面来看.有的一抗既能做白腊切片又能做冰冻切片,而有的一抗只能做冰冻切片,症结取决于所要检测的抗原稳固性,有的抗原不稳固,经由组织固定,脱水.透明.浸蜡.包埋.脱蜡等一系列的做白腊切片的步骤,所检测的抗原易被损坏,这时只能用冰冻切片来做,检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片,而那些稳固的抗原,能经受住白腊切片的的考验,一般来讲也可以用冰冻切片来做,总得来讲,对于既可以用冰冻切片也可以用白腊切片检测的抗原,用白腊切片检测的染色后果要比冰冻切片好一些.2.从研讨目标来看.白腊切片对组织细胞的定位很精确,而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成损坏组织细胞形态的构造,并造成抗原的弥散,从而定位不精确.3.从抗原的保真性来看.冰冻切片反抗原的保真很好,而白腊切片在组织固定,脱水.透明.浸蜡.包埋.脱蜡等进程中可能会反抗原的性质造成影响.4.从操作步骤的繁琐程度看.染色进程冰冻切片简略,而白腊切片请求脱蜡入水.抗原修复等进程,比较繁琐.5.总之,白腊切片对标本的长期保存较合适,且组织细胞形态构造保持好;而冰冻切片合适对新颖组织的制片,然后立刻固定.染色后果较好,且免疫荧光中可以相对避免白腊自觉荧光的干扰.冰冻切片（frozen section）是一种在低温前提下使组织快速冷却到必定硬度,然落后行切片的办法.因其制造进程较白腊切片快捷.轻便,而多运用于手术中的快速病理诊断.冰冻切片的种类较多,有低温恒冷箱冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,甲醇轮回制冷冰冻切片法等.这些办法,跟着时期的变迁,科技的成长,很多年前被以为是异常重要的技巧,如今也慢慢被镌汰了.当然有些技巧,如低温恒冷箱冰冻切片法,正在受到青睐.编辑本段冰冻切片的运用（1）在手术进行中,忽然发明病人的病变与原诊断,原定手术计划不相相符,或者疑惑时,须要病理肯定.（2）懂得淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞,或者转移的程度,以利于肯定是否须要彻底清除淋巴结或者其它的治疗措施.（3）对于已肯定为恶性肿瘤的患者,则须要懂得其手术规模是否足够,高低切缘是否有残存的肿瘤组织.（4）在做剖腹探查时所发明的肿块或者异样的组织.（5）显示组织中的脂肪和脂类物资,这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤,某些科研组织等.（6）某些酶的显示如ATP酶,琥珀酸脱氢酶等.（7）精神病理学技巧中的某些染色法如：Eager氏法,Marchi氏法,Cajal氏法,Hortega氏法和Holzer氏法等.（8）对某些物资所进行的免疫荧光的研讨.编辑本段冰冻切片的制造办法低温恒冷箱冷冻切片制造法以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例,该机的箱面上有电子掌握板,装有即时冷冻键和除霜键,启动即时冷冻键,机械立时进行工作状况,并可中断10mins.启动即时除霜键,可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除失落,并可中断15mins.有照明键一个,启动该键可照明工作间,有利工作及不雅察组织的冰冻状况.配有消毒键一个,当进行一周的工作或者一天的工作后,启动该键,可对工作间进行消毒.当天天工作完毕时,可启动密锁键,锁住工作间.除此之外,箱面的左边有四个按键,两个为快速主动进退键,两个为渺小进退键,还有一个手动旋钮,调节修组织块时的进退.冷冻箱内左边的冷冻台,温度可达-60℃阁下,冷冻箱的中央为一台切片机,工作间的温度在0-30℃间可随意率性调节,并在箱面上的荧屏显示出来.操作办法及步骤①取材,未能固定的组织取材,不能太大太厚,厚者冰冻费时,大者难以切完全,最好为24×24×2mm.②掏出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上,冰冻.小组织的应先取一支承器,滴上包埋剂让其冷冻,形成一个小台后,再放上渺小组织,滴上包埋剂.③将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进退键,迁移转变旋钮,将组织修平.④调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在5～10um间.⑤调好防卷板.制造冰冻切片,症结在于防卷板的调节上,这就请求操作者要仔细,精确地将其调较好,调校至恰当的地位.切片时,切出的切片能在第一时光顺遂地经由过程刀防卷板间的通道,平整地躺在持刀器的铁板上.这时便可掀起防卷板,取一载玻片,将其附贴上即可.⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度.冷冻箱中冷冻度的高下,重要根据不同的组织而定,不能一概而论.如：切未经固定的脑组织,肝组织和淋巴结时,冷冻箱中的温度不能调太低,在-10- -15℃阁下,切甲状腺.脾.肾.肌肉等组织时,可调在-15～20℃阁下,切带脂肪的组织时,应调至-25℃阁下,切含大量的脂肪时,应调至-30℃.冰冻切片时的留意事项①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净,需经常用毛笔挑除切片残余和用柔嫩的纸张擦.有时须要每切完一张切片后就用纸擦一次.因为这个地方是切片经由过程和附贴的地方,假如有残余的包埋剂粘于刀或板上,将会损坏甚至扯破切片,便切片不能完全切出.②多例多块组织同时需做冰冻切片时,可各自放于不同的支承器上,于冷冻台上冻起来,然后根据不同的编号,依序切片,如许做既不费时也不会乱.③放置组织冰冻前,应视组织的外形及走势来放置,所谓“砍柴看柴势”,切片也是如斯,假如胡乱放置,就不能收到很好的后果.④组织块不须经各类固定液固定,尤其是含水的固定液,在未达到固定前,更不能运用.临床快速冰冻切片,不须要预先固定,一是为了争夺时光,二是固定了的组织,反而增长了切片的难度.假如运用未完全固定的组织做冰冻切片,就会消失冰晶.这是因为含水的固定液在组织未经固定前,个中的水份也可渗入到组织中去,当冰冻产生时,这些水份就存留于组织中,形成了冰晶.⑤当切片时,假如发明冰冻过度时,可将冰冻的组织连同支承器掏出来,在室温逗留少焉,再行切片,或者用口中哈气,或者用大拇指按压组织块,以此来软化组织,再行切片.另者,调高冰冻点.⑥用于附贴切片的载玻片,不能存放于冷冻处,于室温存放即可.因为当附贴切片时,从室温中掏出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时,因为两种物资间温度的差别,当它们碰撞在一路时,分子彼此间产生转移而产生了一种吸附力,使切片与载玻片稳固地附贴在一路.假如运用冷藏的载玻片来附贴切片,因为温度雷同,没有产生上述的现象.冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后,立刻放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色.以往,为了防止切片脱落,当切片附贴于载玻片后,即用电吹风吹干后再固定.根据试验比较以为这种做法欠妥未经固定的切片,强热感化后,蛋白产生变性,核内含有的物资因为热的感化融会在一路,染色后镜下分辩不出核内的各类物资.冰冻切片附贴于载玻片后,立刻放入恒冷箱中的固定液固定,如许可以使切片中细胞内各类物资都在没有任何变化的情形下被固定起来,核染色质清楚,核仁显著,其他物资都无缺保存.办法：① 切片固定30秒－1分钟.② 水洗.③ 染苏木素3－5分钟.④ 分化.⑤ 于碱水中返蓝20秒.⑥ 伊红染色10－20秒.⑦ 脱水,透明,中性树胶封固.冰冻组织1－2分钟,切片1分钟,固定1分钟,染色共五分钟.总共在10分钟内完成快速制片进程,成果与白腊切片不相高低.冰冻切片的办法还有很多种,如甲醇轮回的半导体冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等,这些办法在今朝来说已很少运用,是以在这里不作阐述.编辑本段优缺陷（一）长处：1．轻便,可以不须要对组织固定.脱水.透明.包埋等手续即可进行切片,削减了一些中央环节.2．快速,用时短.3．组织变化不大.4．能很好保存脂肪,类脂等成分.5．可以或许比较无缺地保存各类抗原活性及酶类,特殊是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受才能较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好.（二）缺陷：1．不轻易做中断切片.2．切取的组织不能过大,组织过大不轻易冻结或者组织冻结不均,影响切片及染色后果.3．不轻易制造较薄的切片.4．组织块在冻结进程中轻易产生水的结晶而影响细胞的形态构造及抗原物资的定位,并且组织构造也不如白腊切片清楚.编辑本段冰冻切片操作中的留意事项（1）新颖的组织制备组织尽可能新颖.骤冷愈快愈好,才能避免冰晶,常用的骤冷剂有：① CO2气（－78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚.乙烷和庚烷（－80℃）③ 液氮（－190℃）④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）.液氮实用于组织化学,较安全.缺陷：组织块易产生龟裂.（2）固定组织的制备为防止水解酶和其他物资的移位.弥散,常用4℃.24小时的甲醛固定能很好地保存酶类.但对很多脱氢酶和转移酶能灭活.故不宜运用,低温,冷甲醛短时光固定（10分钟阁下）固定,可显示琥珀酸脱氢酶.电镜消失后,须要保存细胞的超微构造,以4％缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml;0.1M二甲胂酸（pH7．）84ml;蔗糖8g）固定较好.这些固定液重要用于水解酶,而不适于很多氧化还原酶和转移酶.（3）恒冷箱温度一般在冷冻后10分钟,到接近冷室温度时再切,一般组织在－15～－20℃切片最易成功.每种组织有其合适的切片温度.刀的温度和冷室温度,Pearse及Bancroft的经验如下：组织刀温度组织温度恒冷箱温度肝 -18 -10 -5肾 -15 -8 -5皮肤 -35 -10 -5脑 -18 -5 -5固定组织一般高3-5度（4）切片机的运用抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离,使切片腻滑经由过程.抗卷板略高于刀面的最高点.可凭经验调剂刀对组织的角度,一般新刀为20゜.操作程序：先接通电源,调定恒冷箱温度,调剂切片刀的角度,调定切片厚度,标本置载台致冷达所需温度后,将其安放在切片机推动器上.即可切片. 恒冷箱视运用情形每周或每月干净一次冰霜.新刀切片满足,旧刀用主动磨刀机磨刀较好.假如切片刀与抗卷板的地位,角度合乎请求,又有一把锋利的刀,就能获得幻想的切片。
冰冻切片与石蜡切片的区别
1．冰冻切片是免疫构造化教染色中最时常使用的一种切片要领.其最超过的便宜是不妨较完佳天保存多种抗本的免疫活性，越收是细胞表面抗本更应采与冰冻切片.新陈的构造及已牢固的构造均可做冰冻切片.之阳早格格创做冰冻时，构造中火份易产死冰晶，往往做用抗本定位.普遍认为冰晶少而大时，做用较小，冰晶小而多时，对于构造结构益伤较大，正在含火量较多的构造中上述局面更易爆收.冰晶的大小与其死少速率成正比，而与成核率（产死速率）成反比，即冰晶产死的数量愈多则愈小，对于构造结构做用愈宽沉.果此，应尽管落矮冰晶的数量.Fish认为冰冻启初时，冰晶成核率较缓，以来渐渐减少，其临界温度为-33.C,从-30.C 落至-43.C之间，成核率慢遽减少达1018，而后再减缓.鉴于上述表面可采与以下步伐缩小冰晶的产死.（1）速冻，使构造温度骤落，支缩从-33.C43.C的时间，缩小冰晶的产死.其要领有二：①搞冰-丙酮（酒粗）法：将150-200ml丙酮（酒粗）拆进小保温杯内，渐渐加进搞冰，曲至鼓战呈粘稀状，再加搞冰出有再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内拆同戊烷约50ml，再将烧杯缓缓置进搞冰丙酮（杂酒粗）鼓战液内，至同戊烷温度达-70℃时即可使用.将构造（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）加进同戊烷内速冻30-60s后与出，或者置恒热箱内以备切片，或者置-80℃矮温冰箱内贮存.②液氮法：将构造块仄搁于硬塑瓶盖或者特造小盒内（曲径约2cm），如构造块小可适量加OCT包埋剂浸出构造，而后将特造小盒缓缓仄搁进衰有液氮的小杯内，当盒底部交触液氮时即启初气化沸腾，此时小盒脆持本位切勿浸进液氮中，约莫10-20s构造即赶快冰结成块.与出构造冰块坐时置进-80℃冰箱贮存备用，或者置进恒热箱切片机冰冻切片.（2）将构造置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用下渗吸支构造中火分，缩小构造含火量.做用冰冻切片的果素较多，果此，技能易度较大，采用佳的冰冻切片机是包管切片品量的关键.久时冰冻切片机有二类：①恒缓冰冻切片机（Cryastat）：为较理念的冰冻切片机，型号很多，但是其基础结构是将切片机置于-30℃C矮温稀关室内，故切片时出有受中界温度战环境做用，可连绝切薄片至2-4μm，真足能谦脚免疫构造化教标记表记标帜央供.切片时，矮温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过矮构造易破碎，抗卷板的位子及角度要适合，载玻片附揭构造切片，切勿上下移动.②启搁式冰冻切片机：包罗半导体致热切片机战甲醇致热切片以及老式的CO2、氯乙烷等热冻切片机.切片时表露气氛中，温度出有简单统造，切片技能易度大，正在下温季节，切片越收艰易，且切片薄8～15μm，出有简单连绝切片，但是其便宜是价廉，海内有死产.冰冻切片后如出有染色，必须吹搞，贮存矮温冰箱内，或者举止短促预牢固后贮存冰箱保存.2．石蜡切片其便宜是构造结构保存良佳，正在病理战回瞅性钻研中有较大的真用价格，能切连绝薄片，构造结构浑晰，抗本定位准确.用于免疫组化技能的石蜡切片造备与惯例造片略有分歧：①脱火、透明等历程应正在4℃.C下举止，以尽管缩小构造抗本的益坏.②构造块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使构造充分脱火、透明、浸蜡.③浸蜡、包埋历程中，石蜡应脆持正在60℃以下，以溶面矮的硬蜡最佳（即矮温石蜡包埋）.构造块脱火、透明、浸蜡时间参照表1-3：表1-3 构造块处理时间表1 70%乙醇4℃ 3～4h2 80%乙醇4℃ 3～4h3 90%乙醇4℃ 2～3h4 95%乙醇Ⅰ 4℃ 2～3h5 95%乙醇Ⅱ 4℃ 1～2h8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.5～1h9 二甲苯Ⅱ 4℃ 0.5１～1h10 石蜡Ⅰ 60℃ 1h11 石蜡Ⅱ 60℃ 2h以上齐历程为18-24h，也可正在室温内使用自动脱火机代替.如构造块小，曲径小于0.5cm，可用赶快石蜡包埋切片，齐历程只需4h安排.石蜡切片为惯例造片技能，切片机多为轮转式，切片薄度2～7μm，应用范畴广，出有做用抗体的脱透性，染色匀称普遍.由于甲醛牢固、有机熔剂战包埋剂对于组抗本有一定的益伤及遮蔽，使抗本特性爆收改变.有人报告经蛋黑酶消化，不妨革新光镜免疫组化染色强度，时常使用的有胰蛋黑酶、链霉蛋黑酶及胃蛋黑酶等消化法.石蜡切片应进37℃恒温箱过夜，那样烤片可缩小染色中脱片局面.切片如需少久贮存，可存搁于4℃冰箱内备用.石蜡切片便宜较多，但是正在造片历程中要通过酒粗、二甲苯等有机溶剂处理，构造内抗本活性得来较多，有人采与热冻搞燥包埋法（Freeze drying embedding methed），不妨保存构造内可溶性物量，预防蛋黑变性战酶的得活，进而缩小了抗本的拾得.该法是将新陈构造矮温速冻，利用热冻搞燥机（Freezing dryer）正在真空、矮温条件下排除构造内火分，而后用甲醛蒸气牢固搞燥的构造，末尾将构造浸蜡、包埋、切片.此法可用于免疫荧光标记表记标帜、免疫酶标记表记标帜及搁射自隐影.。
石蜡切片与冰冻切片对比全集
石蜡切片与冰冻切片对比全集石蜡切片与冰冻切片《一》石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片(section)。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为5～7um，也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um。
切好的蜡带，放人40℃左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在30％的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45～50℃的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅烷等处理。
《二》冰冻切片冰冻切片(fiozen section)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。
恒冷箱切片机(cryostat)是目前最常用的冰冻切片机，可得到3—5um 的连续薄片。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1．防止组织中冰晶形成的方法(1)速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1)干冰—丙酮(乙醇)法：将150～200ml丙酮(无水乙醇)装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰—丙酮(或无水乙醇)饱和液内，至异戊烷温度-70℃时即可使用。
石蜡切片与冰冻切片的优缺点
两种切片我都做得比较多。
相比之下，我更喜欢石蜡切片。
石蜡切片的最突出优点是标本可以长期保存。
在这次试验结束的若干年后，还可以用来做别的指标。
对于比较珍贵的标本，如罕见的临床标本，石蜡切片是比较好的选择。
我觉得石蜡标本的好坏取决于固定的质量。
个人认为组织块不宜过大，固定时间不宜过长。
我的经验是取火柴头大的组织，4%多聚甲醛或10%福尔马林4摄氏度固定3-4小时。
固定时间太长的话，蛋白质的肽链过度扭曲，抗原决定族被缠绕包裹，不容易做出结果。
石蜡切片的主要缺点是不适合做荧光。
我也不知道为什么，反正我老板是这么说的。
可能是由于石蜡有自发荧光的缘故。
我也试过用石蜡切片做荧光，效果还可以。
可是文章中这么做的确实很少。
冰切相对简单，容易出结果。
大多数人是用新鲜组织直接冰切，然后丙酮固定。
这样做虽然省事，可固定完了以后要马上漂洗、孵抗体或染色，不能让切片晾干，不然形态会非常糟糕。
我喜欢先用4%多聚甲醛或10%福尔马林固定，然后蔗糖脱水，再切片。
这样虽然麻烦一些，可切片的形态会好很多。
切片可以晾干，而且在4摄氏度下可以保存1-2个月。
千万不能放-20度保存，否则会有严重的冰晶，切记。
冰冻切片最大的问题还是标本不能长期保存，要现取现做。
适合用于容易获取的动物标本。
chengjinxiang wrote:做冰冻切片的组织可以是直接放在液氮里直接冻存的组织吗？石蜡切片前的福尔马林固定的组织过大会怎么样，我们因为自己没有机器通常是把组织扔到甲醛里直到有一定量和有足够多标本才去包蜡块这样对组化结果有什么影响？做冰切的组织可以先在液氮中长期保存。
而且经过液氮冻存的组织冰切后的形态特别漂亮，一点儿冰晶都没有。
不过保存之前要先用OCT包埋。
切片之前要把冰切机预冷到工作温度（-20度以下）。
包埋块从液氮中一拿出来就要放进冰切机中，不能让包埋块融化，否则还是会出现严重的冰晶。
做HE染色的话，组织固定时间长一点儿没关系。
但如果做免疫组化的话，固定时间就不能太长。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片(section)。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为5～7um，也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um。
切好的蜡带，放人40℃左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在30％的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45～50℃的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片(fiozen section)是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1．防止组织中冰晶形成的方法(1)速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1)干冰—丙酮(乙醇)法：将150～200ml丙酮(无水乙醇)装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰—丙酮(或无水乙醇)饱和液内，至异戊烷温度-70℃时即可使用。
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别一、石蜡切片把修好的蜡块装在旋转切片机上，即可进行切片（sectio n）。
切片必须保持切片刀锐利，切片厚度通常为 5〜7um也可根据染色需要切成不同厚度，一般不旋转式切片机超过10um切好的蜡带，放人40C左右的温水中将蜡片展平。
良好的切片应无刀痕、裂痕，切片厚度均一平整。
切片如有上述问题，在进行免疫组织化学染色时会出现假阳性现象。
为能得到平整无皱褶的组织切片。
可采用两次展片，即先将组织切片漂浮在 30%的乙醇溶液中进行第一次展片，然后将切片捞起，再次放人45〜50C的水浴中进行第二次展片，乙醇的浓度和水温可视组织不同和石蜡熔点的高低自行调整。
此过程是利用乙醇溶液与水之间的张力差展开切片的皱褶。
为防止脱片，载玻片要涂黏片剂。
对HE染色的切片, 可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，但蛋白甘油因含蛋白易导致非特异性免疫反应，故用于免疫组织化学染色的切片常用多聚赖氨酸、3—氨丙基一乙氧基甲硅烷等处理。
二、冰冻切片冰冻切片（fiozen section）是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。
新鲜组织和已固定的组织均可作冰冻切片。
为了得到高质量的冰冻切片，选择好的冰冻切片机和配套的一次性刀架是保证切片质量的关键。
组织在切片前需要冰冻，而冰冻过程容易使组织中的水分形成冰晶，从而影响抗原定位。
一般认为，冰晶体积大而量少时，影响较小；冰晶体积小而量多时，对组织结构损害较大。
含水量较多的组织中较易出现冰晶。
1 •防止组织中冰晶形成的方法（1）速冻：使组织温度骤降，减少冰晶的形成。
方法包括：1）干冰一丙酮（乙醇）法：将150〜200ml丙酮（无水乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70 C,用一小烧杯内装异戊烷约50ml，将此烧杯缓慢置人干冰一丙酮（或无水乙醇）饱和液内，至异戊烷温度-70 C时即可使用。
免疫组化常见问题
免疫组化常见问题与回答集锦一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80ºC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到 4 μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2.应用范围的选择。
有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3.种属反应性的选择。
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
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石蜡切片与冰冻切片
一、组织和细胞标本类型：
（一）组织标本类：
1、石蜡切片：组织形态保存好
2、冰冻切片：抗原性保存好
（二）细胞标本类：
1、组织印片
2、细胞培养片（细胞爬片）
3、细胞涂片
二、组织取材
1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。
2、组织取材注意事项：
（1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。
动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。
（2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。
（3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。
三、活细胞标本的制备法
（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
四、石蜡切片的制备
1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。
因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。
2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间
75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。
五、冰冻切片的保存和使用
1、冰冻切片固定后-80℃保存备用
2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。