小RNA转染,慢病毒转染
sirna转染原理
sirna转染原理Sirna（小体RNA）技术是一种新型的分子技术，可以靶向性地抑制某些特定基因，用于研究基因表达、调节合成物质和活性蛋白质的水平，以及治疗细胞病毒学和遗传学疾病。
Sirna转染作为许多基因治疗方法的关键技术，可以有效地将Sirna片段迅速、安全地转染到细胞内，为研究和治疗提供新的途径。
本文就Sirna转染原理及其在基因治疗中的应用进行综述。
Sirna转染原理Sirna转染的原理是利用Sirna片段在细胞中进行有效的“封锁”，封锁被封锁基因的表达，从而达到调节基因表达的目的。
Sirna片段是由特定的RNA序列组成，长度为19-25个核苷酸，能够结合到mRNA，形成mRNA-Sirna复合物。
当其复合后，mRNA的解读将受到抑制，而蛋白质的合成也将减少，从而达到调节基因表达的目的。
Sirna转染的方法Sirna转染具有多种方法，包括化学递送、化学封装和抗体介导等。
1.学递送化学递送是最常用的Sirna转染方法，典型的化学递送剂有三聚脂散（Lipofectamine）、一及二聚脂散（Lipofectin）、二乙醇胺（DEAE）等。
化学递送剂能够有效地将Sirna片段递送到细胞内，可以提供最大的转染效率。
2.学封装化学封装技术是把Sirna溶解在定制的化学封装剂中，形成脂质微粒，然后将其投放到细胞内以进行转染。
相比常规的化学方法，化学封装有更强的转染能力，可以在短短几分钟内转染细胞；但由于它的转染效率取决于封装剂的组成，所以任何实验室都可以自行封装Sirna转染剂，这会极大地缩短转染时间。
3.体介导抗体介导转染是把Sirna片段结合到特定抗体上，然后利用抗体来将Sirna片段递送到细胞内，通过细胞内抗体受体，将Sirna片段发送到细胞内，从而达到抑制特定基因表达的目的。
采用抗体介导转染技术，可以实现更高的转染效率，还能保护Sirna片段不受酶的侵扰，让转染的Sirna片段有更好的活性。
慢病毒转染
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
rna转染原理
rna转染原理RNA转染原理什么是RNA转染？RNA转染是一种将外源性的RNA分子引入细胞的方法，使其在细胞内进行功能表达的过程。
通过RNA转染，我们可以研究特定的基因功能、调控细胞过程、治疗疾病等。
RNA转染的原理RNA转染是通过特定的载体将外源性的RNA分子导入目标细胞内，使其被细胞摄取并发挥相应功能。
RNA转染主要有以下几种原理：1. 离子转染法离子转染法是最常用的RNA转染方法之一。
在离子转染法中，RNA 分子与阳离子聚合物相互结合，形成带有正电荷的复合体。
这些正电荷的复合体将与细胞膜表面的负电荷相互作用，从而被细胞摄取。
2. 内生性载体转染法内生性载体转染法是利用细胞内已有的小体囊泡来转运RNA分子。
这些小体囊泡，如外泌体或内质网囊泡，可以将RNA包裹在内，并与细胞膜融合，将RNA释放到细胞内。
3. 脂质体转染法脂质体转染法是通过将RNA包裹在特定的脂质体内，形成脂质体-RNA复合体。
这些复合体与细胞膜融合后，RNA会被细胞吞噬，并在细胞内释放。
4. 电穿孔法电穿孔法是利用高电压脉冲破坏细胞膜的完整性，形成短暂的孔道。
这些孔道让RNA分子能够进入细胞内。
5. 磁性导向法磁性导向法是将RNA分子与带有磁性颗粒的复合物结合，在外加磁场作用下，引导RNA复合物进入靶细胞内。
RNA转染的应用RNA转染方法的不同原理使其适用于不同的研究领域和应用场景。
•在基因功能研究中，通过转染特定的siRNA或shRNA，可以实现基因沉默或抑制，研究基因对细胞过程的影响。
•在基因治疗领域，通过转染mRNA或其他介导性RNA （如CRISPR-Cas9系统），可以修复或替代缺陷基因，用于治疗遗传性疾病。
•在药物筛选中，通过转染控制性RNA（如miRNA）或酶RNA，可以评估候选药物对基因或蛋白质表达的调控效果。
RNA转染方法的持续发展和创新，为基因研究和治疗领域提供了强大的工具和平台。
随着技术的进步，我们可以预期RNA转染在科学研究和医学实践中的应用将更加广泛。
慢病毒转染实验流程
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1. 病毒液与靶细胞准备。
将慢病毒液从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化。
慢病毒转染
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA 启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
各种转染方法比较
各种转染方法比较转染是将外源DNA或RNA导入体细胞的一种常用技术，用于研究基因功能、疾病机制、基因治疗等领域。
常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒载体介导转染和生物矢量直接注射法等。
下面将对这些转染方法进行详细比较。
1.化学法：化学法是最简单、最常用的转染方法之一，主要通过化学试剂与DNA或RNA形成复合物，进而被细胞摄取。
常用的化学试剂有钙磷酸盐、聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体、高分子聚合物等。
化学法的优势在于易操作、适用于不同细胞类型，且无需特殊设备。
但其转染效率相对较低，引起细胞毒性的风险较高。
2.电穿孔法：电穿孔法又称为电转染法，通过利用电场作用使细胞膜发生瞬时通透性，使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法可使用电脉冲仪或特殊转染设备进行操作，适用于多种细胞类型。
相比于化学法，电穿孔法的转染效率更高，但对细胞的毒性稍高。
3.病毒载体介导转染：病毒载体介导转染是一种高效的转染方法，常用的病毒载体有腺病毒（Adenovirus）、腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）、逆转录病毒（Retrovirus）和慢病毒（Lentivirus）等。
这些病毒载体不仅能将外源DNA或RNA导入细胞，还能使其在细胞内稳定表达。
病毒载体介导转染的优势在于高转染效率、稳定表达，适用于许多细胞类型。
然而，为了避免潜在的致病性和免疫反应，需要选择无毒性、无致病性的病毒载体。
4.生物矢量直接注射法：生物矢量直接注射法是将外源DNA或RNA直接注射到体内，让其进入目标细胞。
这种方法适用于许多动物模型研究，如小鼠、斑马鱼等。
生物矢量直接注射法的优势在于转染效率高、实验操作简单，但对于人体病理研究等实验要求较高的场景，其应用范围较窄。
根据以上比较，选择适合自己研究需求和细胞类型的转染方法非常重要。
需要考虑的因素包括转染效率、细胞毒性、操作难度、成本等。
在实际应用中，有时也可结合多种方法，例如将化学法与电穿孔法相结合，能够提高转染效率。
慢病毒转染原理
慢病毒转染原理慢病毒转染是一种常用的基因转染方法，适用于长期表达外源基因的研究。
慢病毒转染原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并将其整合入宿主细胞基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。
本文将从慢病毒转染的原理、步骤和应用等方面进行介绍。
慢病毒转染原理。
慢病毒转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，将外源基因插入慢病毒载体中，构建成慢病毒表达载体；然后，将慢病毒表达载体转染至包装细胞中，利用包装细胞的辅助病毒蛋白包装慢病毒颗粒；最后，将包装好的慢病毒颗粒用于感染目标细胞，外源基因被整合入宿主细胞基因组中，实现稳定表达。
慢病毒转染步骤。
慢病毒转染的步骤包括慢病毒载体构建、包装细胞培养、病毒颗粒包装和目标细胞感染等。
首先，构建慢病毒表达载体时，需要选择合适的慢病毒载体和适当的启动子，将外源基因插入载体中，并经过序列分析和酶切验证。
其次，包装细胞的培养和病毒颗粒包装是慢病毒转染的关键步骤，需要选择合适的包装细胞系，转染慢病毒表达载体并培养包装细胞，最终收集包装好的慢病毒颗粒。
最后，利用包装好的慢病毒颗粒感染目标细胞，实现外源基因的稳定表达。
慢病毒转染应用。
慢病毒转染在基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域具有广泛的应用。
在基因功能研究中，可以利用慢病毒转染实现基因敲除、过表达和靶向修饰等，进而研究基因在生理和病理过程中的功能。
在基因治疗中，慢病毒转染可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和传染病等，为基因治疗提供了重要的技术支持。
在细胞工程中，慢病毒转染可以用于改良细胞系，提高细胞的表达稳定性和产量，满足生物制药和工业生产的需要。
总结。
慢病毒转染是一种重要的基因转染方法，具有稳定、高效、广泛应用等特点。
通过慢病毒转染，可以实现外源基因在宿主细胞中的稳定表达，为基因功能研究、基因治疗和细胞工程等领域提供了重要的技术支持。
因此，深入理解慢病毒转染的原理和步骤，对于开展相关研究具有重要的意义。
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三、RNAi转染真核细胞
1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）
（1）将覆盖率为30-50%（低密度转染细胞可以使转染和分析之间的间隙更长）的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
（2）取质粒100pmol稀释到250μl的only体系中，同样取lipo2000试剂5μl稀释到250μl的only体系中，室温静置lipo2000稀释液5min（注意避免不要使lipo2000直接接触塑料且静止时间不要超过5min）。
（3）5min后将质粒稀释液加入到lipo2000稀释液中，颠倒混匀后室温静置20min （注意不要超过20min）。
（4）将孵育好的混合物缓慢匀速加入6孔板中，且最好边加边晃动板子，避免lipo2000局部毒性对细胞造成损伤。
（5）加完后放入37℃培养箱内培养，转染6h后更换新鲜培养液。
（6）24h显微镜下观察细胞状态及时处理（如荧光强弱、传入10cmdish内等），如需药筛48h后即可加药，筛选稳定克隆。
2、Fugene（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）
（1）取覆盖率为80-90%细胞更换新鲜培养液。
（2）将3 μg的DNA稀释到150 μl的only中
（2）取fugene 9μl加入到上述DNA稀释体系中，室温孵育12min。
（3）将孵育好的混合物缓慢加入6孔板内，边加边晃动。
（4）24h后观察细胞状态换液，48h后可以进行药筛筛选克隆。
四、慢病毒转染
1、实验前的准备
（1）质粒的准备：
目的质粒；包装质粒1.0和包装质粒2.0
提质粒时注意用去内毒素的试剂盒提取质粒，根据自己的用量提取质粒，并测浓度。
（2）293T细胞的准备
293T细胞是一种易于转染的工具细胞，可作为病毒包装的细胞，在10cm的dish中铺好293T 细胞，并待铺到80%时，就可以转染了。
（3）转染试剂的准备
转染293T时，用普通的转染试剂（本组用lipo2000和Fugene），本组的转染试剂转染10cm的dish时约需50μl，因此实验前应确认转染试剂是否充足。
（根据转染细胞的多少，确定转染试剂的用量，具体见转染试剂说明书）
（4）宿主细胞的准备
293T细胞转染后约48h后可收集好病毒，因此在病毒收集前24h应将目的
细胞铺到六孔板中，等病毒收集好以后即可感染。
一般从一个10cm的dish中收集到的病毒可以感染2-3个孔（六孔板）
（5）安全注意事项
慢病毒具有一次感染效力，因此操作时应注意防止慢病毒污染，穿白大衣，戴好手套和口罩，接触过病毒的器具用1%的SDS或巴斯消毒水浸泡过夜扔掉。
在安全柜中操作，不能在一般的超净台中操作，操作完的工作台用75%酒精擦拭。
显微镜下观察感染的细胞后，用75%酒精喷撒到载物台上消毒。
离心时，应将离心管管口用封口膜封好后再离心。
2、实验步骤
（1）病毒的包装：共转染293T细胞
项目用量
转染试剂（Fugene/Lipo2000）50μl
目的质粒16μg（20）
包装质粒1.0 8μg（10）
包装质粒2.0 8μg（10）
DMEM 高糖only 补足800μl
总体系800μl
转染的具体步骤根据转染试剂的说明书进行，以下转染试剂及转染质粒的用量是根据本组常规实验拟（转染一个10cm dish的293T），转染时，注意293T 细胞贴壁不牢，转染试剂混合液应从dish的边缘轻轻滴加，并不断的轻轻摇匀。
（2）收集病毒液
a)转染后48h收集病毒液，将培养293T的细胞培养液吸到15ml离心管中，
用封口膜封好后，2000r/min离心5min以去除培养液中的细胞
b)将上清吸出（注意不要吸到管底的细胞）到50ml的浓缩管中，用封口膜
封好后，2500r/min离心约10min，取出观察浓缩管中剩余的病毒液的量，
然后根据病毒液的多少选择离心时间，注意不能将液体离心完，约剩
300-500μl时停止离心
c)用黄枪头吸出病毒液于1.5ml的EP管中，封口膜封好，一般刚收集好的
病毒即可感染目的细胞，若不能马上感染细胞，应保存到-80℃备用（3）感染目的细胞（六孔板）
a)计划每孔感染用的病毒量，根据经验，一个10cm的dish所收集到的病
毒约可感染2-3个孔的细胞
b)给目的细胞直接换液后，加入病毒液和助转剂；或者将目的细胞培养液
换成病毒液、培养液和助转剂混合液
c)72h后加药筛选，若细胞死亡较多，可以隔几个小时给细胞换液，以免
死亡细胞产生有害物质杀死耐药细胞
d)如果转入的质粒带有荧光，可以在荧光显微镜下观察荧光，转染效率
e)待未转染孔的细胞全部死亡，即可挑取细胞克隆（病毒感染可不挑克隆，
但要使感染细胞稳定，挑出克隆较好）。